2017, Vol. 33
邻苯二甲酸酯 (phthalic acid esters，PAEs) 是一类重要的有机化合物，广泛用作塑料的增塑剂。研究显示PAEs是一种内分泌干扰物，可引起雄性生殖发育异常[1-2]。邻苯二甲酸二丁酯 (dibutyl phthalate，DBP) 是PAEs中最常见的一种，对男性生殖的影响已被广泛报道[3-4]。DBP已被中国列为优先控制的环境污染物之一。目前已知睾丸是DBP毒作用的靶器官，DBP可破坏生精上皮结构、损伤睾丸支持细胞与生精细胞间连接、造成生精上皮脱落、导致精子生成障碍[5-6]。连接蛋白43(connexin 43，Cx43) 是睾丸中最主要表达的缝隙连接蛋白，参与构成血-睾屏障 (blood-testis barrier, BTB)，也是多种毒物作用的靶点[7-8]。Cx43表达下调可能是DBP发挥毒作用的机制之一。细胞外调节蛋白激酶 (extracellular regulated protein kinase，ERK) 信号通路是最早发现的经典丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase，MAPK) 信号转导途径。它们存在于睾丸支持细胞及各级生精细胞中，对精子发生与成熟具有至关重要作用，可调节细胞连接蛋白的表达[9-10]。研究表明邻苯二甲酸酯引起的生精阻滞可能与睾丸中的ERK-MAPK信号通路激活有关[11]。本研究旨在观察DBP对大鼠睾丸的损伤作用及机制，结果报告如下。
1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器DBP (分析纯，纯度99.5%)(美国Sigma公司)，大鼠卵泡刺激素 (follicle-stimulating hormone，FSH)、黄体生成素 (luteinizing hormone，LH) 和睾酮酶联免疫吸附法 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 试剂盒 (上海江莱生物公司)；兔抗大鼠ERK1/2、p-ERK1/2和tubulin多克隆抗体 (北京Solarbio公司)；Western blot试剂盒 (武汉博士德公司)；Trizol试剂 (美国Invitrogen公司)；RT-PCR试剂盒[TaKaRa (大连) 公司]，PCR引物由上海生工公司合成。酶标仪、电泳仪 (美国Bio-Rad公司)；WLJY-9000彩色精子质量检测系统 (北京伟力公司)；凝胶成像分析系统 (美国UVP公司)；PCR扩增仪 (美国ABI公司)。
1.2 实验动物分组与处理6周龄清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠32只 (吉林大学实验动物中心)，许可证号：SCXK (吉)2010-0005，体重 (205±10) g。适应性饲养1周，确认正常后纳入实验。大鼠随机分为3个DBP染毒组 (50、500、1 000 mg/kg) 和溶剂 (玉米油) 对照组，灌胃染毒，灌胃量为2 mL/100 g，连续5周，1次/d，染毒结束后，颈椎脱臼法处死大鼠，取血并迅速分离睾丸和附睾。经液氮快速冷冻后-80 ℃保存备用。
1.3 指标与方法 1.3.1 大鼠血清生殖激素水平测定收集血液，2 000 g、4 ℃离心10 min得到血清，运用ELISA测定血清中FSH、LH和睾酮水平，按照试剂盒说明书操作。
1.3.2 精子质量分析取双侧附睾，制备精子滤液；采用精子质量检测系统进行精子密度、精子活率及总畸形率的分析检测。
1.3.3 睾丸组织病理学检查取睾丸样品，4%多聚甲醛溶液固定，常规脱水、石蜡包埋、切片、苏木精-伊红 (haematoxylin and eosin, HE) 染色制作睾丸组织切片。光学显微镜200倍下观察生精上皮细胞层次、形态结构、脱落细胞及管腔受损程度。
1.3.4 睾丸组织中ERK1/2及p-ERK1/2蛋白表达检测采用Western blot法，将睾丸剪碎后置于匀浆器中，加入裂解液后匀浆，置于冰上裂解30 min。于4 ℃下13 000 r/min离心10 min，取上清。用牛血清白蛋白 (bovine serum albumin, BSA) 做标准曲线，考马斯亮蓝法测定样品蛋白含量。以每泳道50 μg上样，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (sodium dodecyl-polyacryl gradient gel electrophoresis, SDS-PAGE)。终止电泳后将蛋白电转移至硝酸纤维素膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST (Tris buffered saline with Tween 20，pH=7.4) 溶液于摇床上室温封闭1.5 h；加入一抗 (兔抗大鼠ERK1/2，1:1 000稀释；兔抗大鼠p-ERK1/2，1:2 000稀释)，4 ℃孵育过夜；TBST洗涤4次，每次10 min；加入适当比例稀释的山羊抗兔二抗，室温孵育1.5 h，充分清洗；使用化学发光试剂盒显影，成像系统扫描并采用Quantity One软件分析目标条带的光密度值。结果用目的蛋白与tubulin的比值表示。
1.3.5 睾丸组织中Cx43 mRNA检测采用RT-PCR法，睾丸样品加入1 mL Trizol后匀浆，加入氯仿离心，取上层水相，加异丙醇沉淀，75%乙醇洗涤2次，溶于酰化剂二乙基焦碳酸酯水中，获得总RNA，按总RNA提取试剂盒说明书操作；提取的总RNA反转录获得cDNA，过程参照RT-PCR试剂盒说明书。用于PCR扩增的Cx43引物序列如下，上游:5′-TACCACGCCACCACCGGCCCA-3′，下游:5′-GGCATTTTGGCTGTCGTCAGGGAA-3′。以β-actin作为内参照，引物序列如下，上游:5′-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3′，下游:5′-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3′。PCR循环参数为：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，60 ℃(Cx43)/54 ℃(β-actin) 退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环30次; 72 ℃延伸7 min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，成像分析系统扫描分析结果。
1.4 统计分析数据用表示，采用SPSS 16.0软件包进行统计分析，多样本间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 DBP对大鼠体重和睾丸系数影响 (表 1)
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表 1 DBP对大鼠体重、睾丸重量及睾丸系数影响 (x±s, n=8) |
随染毒剂量增加，各剂量DBP组大鼠体重、睾丸重量与睾丸系数呈逐渐降低趋势；与对照组比较，中、高剂量DBP组大鼠睾丸系数下降，差异有统计学意义 (P < 0.05)。
2.2 DBP对大鼠血清生殖激素水平影响 (表 2)|
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表 2 DBP对大鼠血清生殖激素水平影响 (x±s, n=8) |
与对照组比较，中、高剂量DBP组大鼠血清中FSH水平升高，高剂量DBP组大鼠血清中LH水平升高，差异有统计学意义 (P < 0.05)；与对照组比较，中、高剂量DBP组大鼠血清中睾酮水平明显下降，差异有统计学意义 (P < 0.05)。
2.3 DBP对大鼠睾丸精子质量影响 (表 3)|
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表 3 DBP对大鼠精子质量影响 (x±s, n=8) |
与对照组比较，高剂量DBP组大鼠精子密度、精子活率明显下降，差异具有统计学意义 (P < 0.05)；与对照组比较，中、高剂量DBP组大鼠精子总畸形率明显升高差异具有统计学意义 (P < 0.05)；呈剂量效应关系。
2.4 DBP对大鼠睾丸组织形态学影响 (图 1)
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注：A：对照组；B、C、D：50、500、1 000 mg/kg DBP组。 图 1 DBP对大鼠睾丸组织形态学影响 (HE，×200) |
对照组大鼠睾丸曲细精管排列规则，结构完整，管腔中无脱落细胞，支持细胞数量和结构正常 (图 1A)；与对照组比较，低剂量DBP组大鼠睾丸组织结构变化不明显 (图 1B)；中剂量DBP组大鼠睾丸曲细精管排列规则，但直径变小，间质增宽，生精上皮层次减少，而且可见生精细胞脱落现象 (图 1C)；高剂量DBP组大鼠睾丸曲细精管排列明显不规则，生精上皮细胞严重受损，支持细胞锐减，且呈现空泡样改变 (图 1D)。
2.5 DBP对大鼠睾丸ERK通路影响 (图 2)
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注：A：对照组；B、C、D：50、500、1 000 mg/kg DBP组。 图 2 DBP对大鼠睾丸组织中ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达影响 |
对照组、低、中、高剂量DBP组大鼠睾丸组织中ERK1/2与p-ERK1/2表达水平分别为 (0.43±0.05)、(0.47±0.07)、(0.51±0.09)、(0.52±0.06) 和 (0.20±0.06)、(0.25±0.03)、(0.42±0.07)、(0.44±0.03)；与对照组比较，各剂量DBP组大鼠睾丸组织中ERK1/2表达水平无明显变化，中、高剂量DBP组大鼠睾丸组织中p-ERK1/2表达水平明显升高，差异有统计学意义 (P < 0.05)。
2.6 DBP对大鼠睾丸Cx43 mRNA表达影响 (图 3)
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注：A：对照组；B、C、D：50、500、1 000 mg/kg DBP组。 图 3 DBP对大鼠睾丸组织中Cx43 mRNA表达影响 |
对照组、低、中、高剂量DBP组大鼠睾丸组织中Cx43 mRNA表达水平分别为 (0.78±0.03)、(0.59±0.05)、(0.52±0.02)、(0.48±0.03)；与对照组比较，各剂量DBP组大鼠睾丸组织中Cx43 mRNA表达均明明显下调，差异有统计学意义 (P < 0.05)。
3 讨论邻苯二甲酸二丁酯 (DBP) 作为增塑剂大量应用于塑料工业中。由于DBP并未真正与塑料高分子碳链聚合，因此会逐渐释放入环境中，对空气、水体、土壤及生物体造成污染，并可通过不同途径进入人体，对人群健康构成潜在危害[12-13]。作为一种环境内分泌干扰物，DBP具有明显的雄性生殖毒性，可引起雄性啮齿类动物睾丸萎缩、重量减轻、睾丸标志酶活性下降、曲细精管萎缩、生精细胞丧失、生殖道畸形等[5, 14-15]。目前认为DBP对睾丸毒作用机制可能包括干扰生殖激素的生成与调节、引起生殖细胞凋亡、损伤支持细胞等[16-18]，但具体机制尚未完全阐明。雄性生殖功能主要受下丘脑-垂体-睾丸轴调控。下丘脑分泌促性腺激素释放激素 (gonadotropin-releasing hormone, GnRH) 作用于腺垂体，使后者分泌FSH、LH等分别作用于睾丸生精细胞、支持细胞和间质细胞，引起睾酮等雄激素分泌，从而实现生精过程的启动和调节。血清生殖激素的检测可判断睾丸受损状态。本研究结果显示，与对照组比较，高剂量DBP组大鼠血清中FSH、LH明显升高、睾酮水平明显下降。提示，DBP具有雄激素干扰作用，这与已有报道一致[19-20]。
精子质量评价可反应环境因素对雄性生殖损害的最终毒效应。研究发现，DBP可降低雄性动物的精子密度和活率、升高精子畸形率[21-22]，与本研究结果相似。表明DBP干扰了精子发生过程，显示出雄性生殖毒性。本研究睾丸病理学观察显示，DBP导致睾丸组织结构出现损伤，表现为生精小管紊乱、支持细胞空泡化、生殖细胞脱落等。提示DBP除通过内分泌干扰途径间接损伤睾丸外，还可直接对睾丸组织结构造成损害，同时也表明支持细胞可能是DBP直接毒作用的靶点[17]。睾丸支持细胞又被称为生精细胞的保姆细胞，最重要作用是参与构成血-睾屏障 (blood-testis barrier，BTB)。BTB主要由相邻支持细胞间的紧密连接 (tight junction，TJ) 构成，BTB的有序开放是精子生成的重要保证[23]。Cx43是睾丸中表达最多的缝隙连接蛋白，同样也是BTB的构成成分之一。Cx43已被证实可调节紧密连接相关蛋白在支持细胞膜上的分布，由此影响BTB的完整性[24]。睾丸的发育与Cx43密不可分，Cx43敲除或下调可导致睾丸萎缩、BTB解聚[25-26]。而Cx43也是多种外源性化学物诱导产生生殖毒性的重要靶点[27-28]。
ERK是丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 家族中的重要成员之一，其信号转导途径是细胞增殖、分化、凋亡等的信号网络核心[29]。ERK基本信号转导步骤遵循经典的MAPKs 3级酶促级联反应，ERK的活化形式为p-ERK。ERK激活后便可迅速穿过核膜，激活下游转录因子，进一步调节相关基因的转录和蛋白表达，最终影响细胞的代谢和功能，产生特定的生物学效应[30]。ERK信号通路已被证明参与雄性生殖过程的很多阶段，并可介导细胞连接蛋白的表达调控[31-32]。已有报道显示环境毒物引起的支持细胞紧密连接受损与ERK通路激活有关[33]。本研究结果显示，DBP染毒后ERK1/2表达改变不明显，而p-ERK1/2表达明显增加，Cx43 mRNA表达明显下调。提示，DBP所致的睾丸损伤可能与ERK通路激活、Cx43表达下调有关。
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