肝脏疾病是威胁人类健康的主要疾病之一。随着生活水平提高，肝脏疾病的发生率也不断上升。脂肪肝、酒精肝、病毒性肝炎、免疫性肝损伤受到越来越广泛的重视。研究表明，许多肝脏疾病的发生、发展和预后与肝细胞凋亡有密切关系^[1-2]，氧自由基 (reactive oxygen species，ROS) 在肝细胞凋亡发生发展中起着主要作用，几乎所有肝损伤均与自由基所致机体蛋白质氧化损伤有关^[3]。萱草花 (Hemerocallis citrina baroni) 又名黄花菜，是常用的补益类中药，有利湿热、宽胸隔、安五脏、治酒疸，安寐解郁等作用^[4]，中医用来治疗胸隔烦热、肝性黄疸、改善肝功能^[5]。萱草花总黄酮 (Hemerocallis citrina baroni flavonids，HCBF) 是其主要功效成分之一，具有护肝、抗抑郁、镇静催眠、抗氧化等药理作用^[6]。本研究以卡介苗与脂多糖诱导免疫性肝损伤小鼠为模型，通过观察HCBF对小鼠抗氧化能力及肝细胞凋亡相关基因表达影响，探讨HCBF抗免疫性肝损伤作用及机制，结果报告如下。

昆明种小鼠80只，雄性，SPF级，体重 (20±3) g，购于吉林大学动物实验中心，许可证号：SCXK (吉)2010-0001。各组小鼠饲养于吉林医药学院机能实验动物中心，基础饲料喂养，自由饮水，光照时间7:00-19:00，湿度45%，适应饲养1周。

HCBF提取物 (总黄酮提取率为26.5%，1 g提取物相当于生药材28 g，吉林医药学院药学院提取)；卡介苗 (武汉生物制品所)；细菌脂多糖 (lipopolysaccharide, LPS)、2, 4-二硝基氯苯 (2，4-dinitrochlorobenzene，CDNB)(美国Sigma公司)；超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase，SOD)、丙二醛、谷胱甘肽过氧化物酶 (glutathione-peroxidase，GSH-Px) 试剂盒 (南京建成生物工程研究所)；BCL-2-associated X protein (bax)、lymyhoma/leukemia-2 protein (bcl-2) 免疫组织化学试剂盒 (武汉博士德生物工程公司)。BECKMAN CX7全自动生化分析仪 (美国贝克曼公司)；751分光光度计 (上海分析仪器厂)；EL-301型酶联免疫仪 (美国Bio-Tek公司)；Vanox多功能显微镜 (日本Olympus公司)。

取萱草花粗粉适量，添加20倍量70%乙醇，加热、回流提取4 h，提取3次，冷冻干燥，得提取物粉末，按照文献[7]方法测定总黄酮含量，HCBF含量为9.4 mg/g，提取物粉末总黄酮含量为5.6%。取提取物粉末加水溶解成10 g/L水溶液 (总黄酮：0.56 g/L)，作为大孔吸附树脂纯化准备液。取预先处理好AB-8大孔吸附树脂，按照径高比1:6湿法装柱，取准备液6倍柱体积 (bed volume, BV) 上样 (2 mL/min)，用6 BV蒸馏水洗脱除杂 (2 mL/min)，加入30%乙醇洗脱，收集3 BV洗脱液，30%洗脱液浓缩回收乙醇，冷冻干燥，得提取物粉末，依法测定总黄酮含量，纯化粉末总黄酮含量为26.5 %，备用。

小鼠按体重随机分为5组 (n=16)：对照组、模型组、HCBF低、中、高剂量组 (15、30、60 mg/kg)。各组小鼠腹腔注射卡介苗15 mg/g (溶于0.2 mL生理盐水中，新鲜配制)，对照组注射同等体积生理盐水，HCBF各剂量组小鼠灌胃给予相应剂量HCBF，1次/d，连续7 d，对照组小鼠灌胃等量双蒸水。第8天小鼠腹腔注射LPS 2 μg/g，对照组小鼠腹腔注射同等体积生理盐水，8 h后，各组随机取8只小鼠断头处死，分离血清，待测；取肝组织，4 ℃生理盐水冲洗，加双蒸水冰浴匀浆，20%匀浆液离心，取上清，-20 ℃贮存。另8只小鼠，以0.4%戊巴比妥钠 (0.01 mL/g) 腹腔麻醉，开胸，门静脉插管，用灌注液 (4 ℃乙醇、磷酸盐缓冲液50 mmol/L、NaCl 120 mmol/L，乙二胺四乙酸10 mmol/L、pH 8.0) 灌流10 min，取肝脏左叶制备石蜡切片，进行组织病理学检查。

最后一次灌胃8 h后，各组小鼠断头处死，解剖肝、脾称量重量，并按照下列公式计算肝指数、脾指数。肝指数=(肝重量×100%)/体重；脾指数=(脾重量×100%)/体重。

小鼠断头取血1 mL，3 500 r/min离心5 min，分离血清，用自动生化分析仪测定各组小鼠血清ALT活性。

取小鼠肝脏左叶，10%甲醛固定、选块、3 μm切片、苏木精-伊红染色法 (hematoxylin-eosin staining，HE)，200倍显微镜观察。

取肝脏左叶0.5 g，冰冷生理盐水漂洗，去血液，冰浴条件下，以1:4(M/V) 加入生理盐水制成20 %组织匀浆，3 500 r/min低温离心10 min，取上清，采用硫代巴比妥酸反应法检测丙二醛含量，采用硝酸还原酶法检测SOD活力，采用比色法检测GSH-Px活力，严格按照试剂盒说明书操作。

采用免疫组织化学 (streptavidin-biotin complex, SABC) 法^[12]，取小鼠肝组织3×3 mm，固定、脱水、包埋、切片，按常规SABC法烤片、脱蜡，浸入无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ中各3 min，浸入95%、90%、80%、70%酒精中各3 min，蒸馏水洗3 min，浸入3%H₂O₂ 5 min，0.01 mol/L构椽酸盐缓冲液 (pH6) 加热10 min，磷酸缓冲盐溶液 (phosphate buffer saline，PBS) 洗3次，加5%牛血清蛋白封闭液20 min，吸干后加入一抗 (兔抗鼠bax、bcl-2)，4 ℃过夜，PBS洗3次，加入二抗，30 min，PBS洗3次，加入SABC液，20 min，PBS洗3次，二氨基联苯胺 (diaminobenzidine，DAB) 显色，苏木素复染，脱水后，中性树胶封片，显微镜观察。全自动图像分析仪随机取10个视野测定阳性面积，HPIAS图像分析软件计算肝组织阳性细胞面积吸光度平均值，为bax、bcl-2表达相对含量。

数据以±s表示，采用SPSS 16.0软件进行统计分析，组间比较采用t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

对照组、模型组、HCBF低、中、高剂量组小鼠血清ALT活性分别为 (36.83±12.17)、(105.48±46.34)、(65.57±24.54)、(56.38±26.31)、(59.77±13.34) U/L；与对照组比较，模型组小鼠血清中ALT活性明显升高，差异有统计学意义 (P < 0.01)，表明模型建立成功。与模型组比较，HCBF低、中、高剂量组小鼠血清ALT活性均明显降低，差异有统计学意义 (P < 0.05)。

图 1

注：A：对照组；B：模型组；C、D：HCBF 30、60 mg/kg组。 图 1 HCBF对免疫性肝损伤小鼠肝组织病理影响 (HE，×200)

对照组小鼠肝组织结构清晰，肝细胞索排列整齐呈放射状 (图 1A)；与对照组比较，模型组小鼠肝细胞坏死严重，排列紊乱，伴大量淋巴细胞侵润，胞浆水肿，部分细胞出现脂肪空泡变性 (图 1B)；HCBF 30、60 mg/kg剂量组小鼠肝脏可见肝细胞轻度胞浆疏松，炎细胞侵润轻重不一，少量细胞见脂肪空泡，坏死程度较模型组减轻，肝细胞主要表现为胞浆弥漫性水肿 (图 1C、D)。

表 1

表 1 HCBF对免疫性损伤小鼠肝脏抗氧化能力影响 (x±s，n=8) 组别 (mg/kg) SOD (U/mgprot) MDA (nmol/mgprot) GSH-Px (U/mgprot) 对照组 277.18±25.34 4.12±0.56 126.48±3.7 模型组 168.14±13.21a 8.57±0.54a 95.32±1.48a HCBF 15 178.71±17.64b 7.02±0.47 97.53±1.56 30 197.40±25.22b 5.37±0.34b 107.32±1.83c 60 249.41±24.08c 5.52±0.38b 114.24±1.41c 注：与对照组比较，a P < 0.01；与模型组比较，b P < 0.05，c P < 0.01。

表 1 HCBF对免疫性损伤小鼠肝脏抗氧化能力影响 (x±s，n=8)

与对照组比较，模型组小鼠肝组织中SOD、GSH-Px活力明显降低、丙二醛含量明显升高，差异有统计学意义 (P < 0.01)；与模型组比较，HCBF各剂量组小鼠肝脏中SOD活力均明显升高 (P < 0.05)，HCBF中、高剂量组小鼠肝脏中GSH-Px活力均明显升高 (P < 0.01)、丙二醛含量明显下降 (P < 0.05)。

表 2

表 2 HCBF对小鼠体重及肝、脾指数影响 (x±s，n=8) 组别 (mg/kg) 体重 (g) 肝指数 (%) 脾指数 (%) 对照组 25.94±2.81 4.21±0.46 0.45±0.07 模型组 20.09±2.27a 5.34±0.93b 0.58±0.05 HCBF 15 20.71±1.68 4.77±0.56 0.52±0.08 30 21.25±1.99 4.71±0.61 0.49±0.07 60 23.71±2.04c 4.49±0.47c 0.57±0.08 注：与对照组比较，a P < 0.05, b P < 0.01；与模型组比较，c P < 0.05。

表 2 HCBF对小鼠体重及肝、脾指数影响 (x±s，n=8)

与对照组比较，模型组小鼠体重下降 (P < 0.05)，肝指数升高 (P < 0.05)；与模型组比较，HCBF 60 mg/kg组小鼠体重升高，肝指数下降，差异有统计学意义 (P < 0.05)；各组小鼠脾指数变化不明显。

表 3

表 3 HCBF对小鼠肝组织中bax、bcl-2表达影响 (x±s，n=8) 组别 (mg/kg) bax bcl-2 bax/bcl-2(%) 对照组 0.17±0.02 0.12±0.06 1.51 模型组 0.23±0.11b 0.06±0.12a 3.29 HCBF 15 0.22±0.10 0.15±0.04c 1.45 30 0.19±0.09d 0.22±0.10d 0.86 60 0.20±0.07c 0.21±0.09d 0.95 注：与对照组比较，a P < 0.05, b P < 0.01；与模型组比较，c P < 0.05, d P < 0.01。

表 3 HCBF对小鼠肝组织中bax、bcl-2表达影响 (x±s，n=8)

与对照组比较，模型组小鼠肝脏中bax表达升高，bcl-2表达下降 (P < 0.05)，bax/bcl-2比例明显升高；与模型组比较，HCBF 30、60 mg/kg剂量组小鼠肝脏中bax表达下降，bcl-2表达明显升高 (P < 0.05)。

肝是机体物质代谢重要器官，当受到药物、病毒、缺氧、免疫等有害因子侵害时，肝细胞可出现损伤，发生炎症、坏死及纤维化等病理改变。肝损伤发生机制涉及多环节，氧化应激反应在免疫性肝损伤发生发展过程中扮演着重要角色，维持氧自由基动态平衡，可有效减轻肝损伤^[13]。本研究采用卡介苗和脂多糖诱导小鼠免疫性肝损伤，该模型稳定且重现性好。本研究结果显示，HCBF能够明显降低免疫性肝损伤小鼠血清ALT活性，表明HCBF对小鼠肝脏过氧化脂质生成具有明显抑制作用；病理切片结果表明HCBF可明显减轻肝细胞变性、坏死及炎性侵润，减轻肝组织病理性损伤。提示，HCBF对免疫性肝损伤具有保护作用。

SOD是机体抗氧化体系的一种含金属离子酶，可催化超氧自由基的歧化反应，保护细胞膜结构与功能完整性^[14]。丙二醛是自由基代谢机体不饱和脂肪酸形成的脂质过氧化产物。GSH-Px主要作用为清除超氧阴离子 (O₂^-) 和过氧化氢 (H₂O₂)^[15]。本研究结果表明HCBF各剂量组小鼠肝细胞抗氧化酶SOD、GSH-Px活力明显高于模型组，丙二醛含量低于模型组。提示，HCBF可降低卡介苗和脂多糖诱导的免疫性肝损小鼠氧化应激程度。

位于线粒体膜、核膜、内质网膜上的bcl-2蛋白可抑制组织细胞凋亡，其家族中的bax可对抗bcl-2抗凋亡作用，是促凋亡基因。bcl-2与bax形成同二聚体或异二聚体，从而改变线粒体膜通透性，加速细胞凋亡^[16-17]。bax与bcl-2的表达程度与2者比值对细胞凋亡起关键作用^[18]。bax在体内组织中表达较bcl-2广泛，bcl-2在肝组织中仅少量表达或不表达，而bax在肝组织为中等表达。本研究结果显示，对照组小鼠肝脏未见bcl-2蛋白表达，而Bax蛋白在各组小鼠肝脏中均有不同程度表达；与模型组比较，HCBF 30、60 mg/kg组小鼠肝脏bcl-2蛋白表达升高，Bax蛋白表达减少，bax/bcl-2比例下降。提示，HCBF拮抗卡介苗和脂多糖诱导的免疫性肝损伤机制可能与促进肝脏bcl-2表达、降低bax蛋白表达，进而抑制免疫性肝损伤细胞凋亡有关。