近年来，关于氟中毒对机体的损害越来越引起人们的关注，在探讨氟中毒发病机理同时，也在寻求地氟病的有效防治措施。肾脏是氟的主要排泄器官，也是氟中毒靶器官^[1-3]。研究发现染氟后，肾脏组织结构发生改变，肾脏细胞凋亡，DNA损伤^[4]。硒是机体内一种必需微量元素,一些研究表明适量浓度的硒对氟中毒具有拮抗作用^[5-7]，大鼠长期饮用不同浓度配比的氟化钠(sodium fluoride,NaF)和亚硒酸钠(sodium selenite,Na₂SeO₃)水后，发现硒干预组肾脏细胞凋亡率显著小于单独染氟组^[8]。腺苷酸激活的蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)是细胞内能量调节器，在调节能量平衡方面发挥重要作用^[9-10]。线粒体作为细胞能量工厂，与AMPK存在着密切关系，而线粒体途径是主要的细胞凋亡途径^[11-12]。本研究旨在探讨AMPK是否参与硒拮抗氟诱导NRK-52E细胞凋亡过程，结果报告如下。

NaF分析纯(天津市博迪化工有限责任公司)、Na₂SeO₃分析纯(天津化学试剂厂)、高糖(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)培养基、噻唑蓝、细胞蛋白抽提试剂盒、超敏ECL化学发光即用型底物(武汉博士德生物公司)、胎牛血清(杭州四季青公司)、双染色法凋亡检测试剂盒(annexin v-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，V-FITC/PI) 凋亡检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)、AMPK及线粒体通路蛋白抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(美国Cell Signaling 科技公司)。CO₂细胞培养箱(日本 Sanyo 公司)，酶标仪(美国 BIORAD 公司)，FAS Calibur流式细胞仪(美国 BD 公司)，电泳仪(美国 Bio-Rad 公司)，凝胶电泳图像分析系统(美国 UVP 公司)。

大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)购自上海中国科学院细胞库，在37 ℃、5% CO₂及一定湿度条件下，用DEME高糖培养基(含10%灭活胎牛血清，1%青链霉素)进行常规培养，2～3 d传代。

取对数期细胞，随机分为对照组，低、高剂量氟组，低、高剂量硒组，4个硒干预组。对照组细胞只加培养基，低、高剂量氟组细胞培养基中分别含有5、20 mg/L NaF，低、高剂量硒组细胞培养基分别含有17.1、34.2 g/L Na₂SeO₃，4个硒干预组细胞培养基中分别含有5 mg/L NaF+17.1 g/L Na₂SeO₃、5 mg/L NaF+34.2 g/L Na₂SeO₃、20 mg/L NaF+17.1 g/L Na₂SeO₃、20 mg/L NaF+34.2 g/L Na₂SeO₃。染毒72 h。

采用流式细胞仪，每组设6个平行样，细胞以1×10⁶个/mL密度分别接种于25 mL培养瓶中，孵育12 h后，染毒培养72 h，收集细胞，离心，磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)清洗3次(1 000 r/min，5 min)，收集1×10⁵个/mL细胞，加入50 L结合液重悬细胞，加入5 L annexin V-FITC混匀后；加入5 L碘化丙啶，混匀，室温避光孵育10 min，上流式细胞仪检测。Cell Quest 软件获取数据计算细胞凋亡百分率。

采用Western blot法，每组设6个平行样，各组细胞染毒72 h后，收集细胞，细胸裂解缓冲液(radio immunopreciprecipitation assay buffer,RIPA buffer)提取蛋白，内含蛋白磷酸酶抑制剂混合物(phosphatase inhibitor cocktail 100×)，二辛可宁酸试剂定量蛋白，调整浓度，煮沸变性，每孔50 L上样，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate palyacry lamidegel electrophoresis,SDS-PAGE)，进行湿转，5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗AMPK、p-AMPK、bax、cytochrome c (Cyt-C)、pro-caspase-9、pro-caspase-3、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3(1∶1 000)和β-actin(1∶3 000)，4 ℃孵育过夜，Tris盐缓冲液(tert-butyldimethylsilyl,TBS)洗膜3次，二抗IgG-羊抗兔(1∶1 000)37 ℃孵育1 h，洗膜3×10 min，超敏化学(electrogenerated chemiluminescence，ECL)显色，凝胶成像采集系统采集图像，Quantity One 4.6.6 软件分析蛋白条带，蛋白表达量用目的条带光密度(integral optical density，IOD)/β-actin IOD 表示。

数据以x±s表示，采用SPSS 13.0软件进行统计分析，多样本均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用最小显著差法，P<0.05为差异有统计学意义。

对照组、5、20 mg/L NaF组、17.1、34.2 g/L Na₂SeO₃组、5 mg/L NaF+17.1、34.2 g/L Na₂SeO₃、20 mg/L NaF+17.1、34.2 g/L Na₂SeO₃组NRK-52E细胞凋亡率分别为(5.97±0.09)%、(7.92±0.24)%、(11.06±0.17)%、(6.74±0.49)%、(4.93±0.40)%、(8.84±0.10)%、(6.71±0.18)%、(8.46±0.09)%、(9.88±0.08)%；与对照组比较，5、20 mg/L NaF组、5 mg/L NaF+17.1 g/L Na₂SeO₃、20 mg/L NaF+17.1、34.2 g/L Na₂SeO₃硒干预组细胞凋亡率均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与5 mg/L NaF组比较，5 mg/L NaF+34.2 g/L Na₂SeO₃硒干预组细胞凋亡率明显降低；与20 mg/L NaF组比较，20 mg/L NaF+17.1、34.2 g/L Na₂SeO₃ 硒干预组细胞凋亡率均明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。

对照组、5、20 mg/L NaF组、17.1、34.2 g/L Na₂SeO₃组、5 mg/L NaF+17.1、34.2 g/L Na₂SeO₃、20 mg/L NaF+17.1、34.2 g/L Na₂SeO₃组NRK-52E细胞AMPK磷酸化蛋白表达水平分别为(0.16±0.05)、(0.37±0.09)、(0.73±0.16)、(0.13±0.07)、(0.14±0.08)、(0.11±0.03)、(0.12±0.04)、(0.46±0.12)、(0.48±0.15)；与对照组比较，20 mg/L NaF组AMPK磷酸化蛋白水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与5 mg/L NaF组比较，5 mg/L NaF+17.1、34.2 g/L Na₂SeO₃ 硒干预组NRK-52E细胞AMPK磷酸化蛋白表达水平明显降低；与20 mg/L NaF组比较，20 mg/L NaF+17.1、34.2 g/L Na₂SeO₃ 硒干预组NRK-52E细胞AMPK磷酸化蛋白表达水平均明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。

图 1

注：1：对照组；2~3：5、20 mg/L NaF组；4~5：17.1、34.2 g/L Na2SeO3组；6~9：5、20 mg/L NaF+17.1 g/L Na2SeO3组、5、20 mg/L NaF+34.2 Na2SeO3组。 图 1 硒对氟诱导NRK-52E中p-AMPK蛋白表达影响

与对照组比较，20 mg/L NaF组细胞中bax蛋白表达升高(P<0.05)；与20 mg/L NaF组比较，20 mg/L NaF+17.1、34.2 g/L Na₂SeO₃ 硒干预组细胞中bax蛋白表达明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与对照组比较，染氟组细胞中Cyt-C蛋白表达明显升高；与染氟组比较，硒干预组细胞中Cyt-C蛋白表达均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组比较，20 mg/L NaF染氟组细胞中活性caspase-9蛋白表达水平升高，5、20 mg/L NaF组活性caspase-3蛋白表达水平升高；与染氟组比较，硒干预组细胞活性caspase-9、caspase-3蛋白表达水平均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

图 2

注：1：对照组；2~3：5、20 mg/L NaF组；4~5：17.1、34.2 g/L Na2SeO3组；6~9：5、20 mg/L NaF+17.1 g/L Na2SeO3组、5、20 mg/L NaF+34.2 Na2SeO3组。 图 2 硒对氟诱导NRK-52E细胞中凋亡相关蛋白表达影响

表 1

表 1 硒对氟诱导NRK-52E中凋亡相关蛋白表达影响，(x±s,n=6) 组别 NaF(mg/L) Na2SeO3( g/L) bax Cyt-C Caspase-9 Caspase-3 对照组 0 0 0.46±0.16 0.27±0.15 0.20±0.06 0.18±0.10 NaF组 5 0 0.60±0.18 0.52±0.07a 0.36±0.09 0.54±0.08a 20 0 0.99±0.16a 0.73±0.08a 1.17±0.17a 1.51±0.42a Na2SeO3组 0 17.1 0.63±0.13 0.27±0.09 0.44±0.17 0.56±0.07a 0 34.2 0.35±0.11 0.28±0.14 0.27±0.11 0.47±0.11a 硒干预组 5 17.1 0.72±0.19 0.25±0.05b 0.31±0.14 0.36±0.06 5 34.2 0.81±0.196a 0.24±0.07b 0.25±0.07 0.16±0.09b 20 17.1 0.55±0.09c 0.30±0.06c 0.76±0.11c 0.35±0.12c 20 34.2 0.61±0.16c 0.34±0.05c 0.40±0.12c 0.27±0.04c 注：与对照组比较，a P<0.05；与5 mg/L染氟组比较，b P<0.05；与20 mg/L染氟组比较，c P<0.05。

表 1 硒对氟诱导NRK-52E中凋亡相关蛋白表达影响，(x±s,n=6)

细胞凋亡是一个主动的信号依赖过程，可由许多因素诱导，如放射线照射、缺血缺氧、病毒感染、药物及毒素等^[13]。氟具有细胞毒性，研究证明过量氟可诱导细胞凋亡^{[2, 4, 14-16]}。肾脏作为氟的主要排泄器官，氟对肾脏的毒性作用是多方面的^[1-3]，近年来有研究报道，肾小管上皮细胞调亡在慢性肾脏病的发病机制中起着重要作用^[17]。硒是具有抗氧化作用的微量元素，参与保持细胞膜的稳定性和正常通透性，拮抗氟致机体损伤作用^{[5-6, 8, 18]}。本研究结果显示，染氟组NRK-52E细胞凋亡率明显升高；与染氟组比较，硒干预组NRK-52E细胞凋亡率明显降低。提示，高浓度氟可诱导NRK-52E细胞凋亡，一定浓度的硒对氟诱导细胞凋亡具有拮抗作用。腺苷酸激活的蛋白激酶(AMPK)作为细胞能量调节器，可被许多与能量相关的因子激活，活性氧(reactive oxygen species,ROS)是AMPK的上游激活物之一^{[10, 19]}，高浓度川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMPZ)诱导产生大量的ROS可激活AMPK^[10]。机体正常情况下可产生少量ROS，当细胞受到有害刺激时，则产生大量ROS，许多研究也证实氟中毒引起氧化应激的发生，使体内超氧化物水平升高^[20-21]。本研究结果显示，与对照组比较，20 mg/L NaF组NRK-52E细胞中AMPK磷酸化蛋白表达水平明显升高，硒干预组NRK-52E细胞中AMPK磷酸化蛋白表达水平明显降低。表明氟可激活AMPK，上调AMPK磷酸化表达水平，一定浓度的硒可抑制AMPK磷酸化。线粒体作为细胞能量工厂，产生ATP为细胞供能^{[11-12, 22]}，AMPK是细胞能量调节器，在维持细胞能量平衡方面起着关键作用^{[9-10, 19]}，AMPK对能量代谢的调节与线粒体功能密不可分。线粒体调节凋亡途径又称内源性凋亡，Bcl-2蛋白家族成员在其中起着重要调控作用，而bax是该家族中研究最广泛的促凋亡因子^{[12, 23]}。在某些因素刺激下，bax 迁移至线粒体膜上，导致膜通透性改变，Cyt-C释放，经过caspases级联反应，最终导致细胞凋亡^{[12-13, 23]}。有研究发现给予AMPK特异性阻断剂后，bax迁移活动受到抑制^[10]，进而阻断凋亡发生。本研究结果表明染氟组NRK-52E细胞bax蛋白表达水平增高，线粒体中Cyt-C表达增强，活性caspase-9、caspase-3表达水平明显增高；与染氟组比较，硒干预组NRK-52E细胞中bax蛋白表达水平明显降低，Cyt-C蛋白表达下降，活性caspase-9和caspase-3表达水平明显降低。综上所述，硒有助于拮抗氟所诱导的NRK-52E细胞凋亡，其机制可能与硒阻碍AMPK磷酸化，降低下游凋亡相关蛋白表达水平有关。