动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是严重危害人类健康和生命的常见病，是心血管疾病的病理基础，防治AS是预防心脑血管疾病的根本措施。近年来，AS发病率呈上升趋势，已经成为心血管领域研究的热点。目前研究认为AS是一种脂质代谢性疾病^[1]，因此，调节脂质代谢成为防治AS的主要方法。罗布麻叶为夹竹桃科植物罗布麻(Apocynum venetum L.)的干燥叶，为传统中药，具有平肝安神，清热利水之功效，临床主要用于治疗高血压，焦虑、抑郁等疾病^[2]。研究发现罗布麻提取物对动脉粥样硬化及心肌纤维化具有一定的治疗作用^[3-4]，但罗布麻叶提取物为罗布麻叶的粗提物，主要成分并不明确。研究表明黄酮类物质为罗布麻叶主要的有效成分，罗布麻叶总黄酮是罗布麻叶提取分离、纯化后的产物，其总黄酮含量更加明确，疗效更加稳定^[5]。本研究通过维生素D3联合高脂饲料诱导AS大鼠模型，观察罗布麻叶总黄酮对AS大鼠脂质代谢的影响，旨在为进一步开发应用罗布麻叶总黄酮提供实验依据。结果报告如下。

罗布麻生药材产地吉林白城市，由通化师范学院胡彦武副教授鉴定；罗布麻叶总黄酮自制；低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD)及丙二醛试剂盒(南京建成生物工程研究所)；维生素D3注射液(上海通用药业股份有限公司)；辛伐他丁片(杭州默沙东制药有限公司)；胆酸钠、胆固醇(美国Sigma公司)。倒置显微镜(日本Olympus公司)；Infinite M2000 Pro多功能酶标仪(瑞士TECAN公司)；FJ-2000高速分散匀质器(常州丹瑞实验仪器设备有限公司)；超低温冰箱(美国Thermo公司)；T6紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。

雄性Wistar大鼠72只，体重180~220 g，由吉林大学基础医学院动物中心提供，许可证号：SCXK (吉)2013-0001。高脂饲料组成：80.8%基础饲料，3.5%胆固醇、10%猪油、0.2%丙硫氧嘧啶、0.5%胆酸钠、5%白砂糖。

将干燥的罗布麻叶粉碎过20~50目筛成粉状，用10倍量的浓度为75%的乙醇加热回流2 h，提取2次，合并提取液，滤过，回收乙醇，浓缩，得到浓缩液；将浓缩液用D101大孔树脂纯化，先用水洗，再用50%乙醇洗脱，滤液合并、浓缩即得罗布麻叶总黄酮；分光光度法检测提取物总黄酮质量分数(以芦丁计)≥72%，高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography, HPLC)对其中黄酮类物质进行测定，金丝桃苷含量为4.59%、芦丁含量为9.86%、槲皮素为0.12%。

72只大鼠随机分为6组：对照组、模型组、阳性对照组及罗布麻叶低、中、高剂量组，每组12只；除对照组外，其他各组大鼠连续注射维生素D3 3 d (共70 U/kg)，给予高脂饲料9周，对照组给予普通饲料；第10周开始，罗布麻叶低、中、高剂量组大鼠每日灌胃罗布麻叶总黄酮(25、50、100 mg/kg)，阳性对照组灌胃辛伐他丁(4 mg/kg)，对照组及模型组给予同体积生理盐水，1次/d，连续4周，期间给予普通饲料；于造模开始第1、9及13周记录大鼠体重，观察体重变化。给药结束后，大鼠经水合氯醛麻醉，眼球取血，置于离心管中，4 ℃、3 000 r/min离心15 min，分离血清，放入1.5 mL离心管中，-70 ℃冻存；取大鼠胸主动脉，纵向剖开，行大体油红O染色，常规制备石蜡标本，苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色，供病理学观察用。

取油红O 0.5 g，溶于100 mL异丙醇中，制成储备液；将纵向剖开的大鼠胸主动脉，放入储备液中染色30 min，放入70%乙醇中分化，更换6~7次分化液后，以自来水充分冲洗未结合染料，自然晾干后，拍照记录染色情况。

将油红O染色观察后的大鼠主动脉，制备石蜡标本、切片，苏木精染色10 min，流水稍洗，体积分数1%的盐酸酒精分化，流水冲洗数分钟，伊红染色5 min，流水稍洗，梯度酒精常规脱水，中性树胶封片；于光镜下随机选择10个视野，观察大鼠主动脉病理变化。

取冻存血清，室温下溶解，用直接法测定血清中HDL-C、LDL-C水平，cholesterol oxidase-peroxidase (COD-PAP)酶法测定血清中TG水平，GPO-PAP法测定血清中TC水平，应用酶标仪在510 nm波长下(TC、TG)、546 nm波长下(HDL-C、LDL-C)测定吸光度(A)值。AS指数=(TC-HDL)/HDL；AS指数表示高血脂致AS的危险性，AS指数越高，发生AS的危险性越大。

采用WST-1法测定大鼠血清中SOD活力，TBA法测定血清中丙二醛含量，应用酶标仪在450 nm波长下(SOD)、532 nm波长下(丙二醛)测定吸光度(A)值。

数据以x±s表示，采用SPSS 17.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验，以P < 0.05为差异具有统计学意义。

表 1

表 1 罗布麻叶总黄酮对AS大鼠体重影响(g，x±s，n=12) 组别(mg/kg) 第1周末 第9周末 第13周末 对照组 226.33±9.09 295.67±9.15 347.16±17.97 模型组 223.33±16.67 171.25±5.78a 135.36±4.54 阳性对照组 228.83±9.15 172.63±2.61a 158.50±4.20b 罗布麻叶组 25 223.66±8.91 169.89±6.54a 137.33±6.86 50 226.50±10.63 173.20±4.84a 150.33±5.72b 100 227.66±17.26 172.66±4.05a 159.50±6.97b 注：与对照组比较，a P＜0.05；与模型组比较，b P＜0.05。

表 1 罗布麻叶总黄酮对AS大鼠体重影响(g，x±s，n=12)

各组大鼠在实验前(第1周末)体重及一般状态无明显差异；观察期间，对照组大鼠精神状态良好，皮毛光泽，活泼好动，体重随饲养时间增加而增长；模型组大鼠皮毛色泽暗淡，活动减少，精神状态较差，食欲降低，体重明显低于对照组(P < 0.05)；第9周时，各剂量罗布麻叶组大鼠体重与模型组比较无明显差异；第13周末，与模型组比较，阳性对照组、罗布麻叶中、高剂量组大鼠体重明显增加。提示，罗布麻叶总黄酮可一定程度改善AS大鼠的精神状态及食欲。

油红O染色显示，对照组大鼠胸主动脉管壁未见红色斑盐；模型组大鼠胸主动脉上形成大量红色斑盐，并且面积较大；阳性对照组及罗布麻叶中、高剂量组大鼠胸主动脉脂质斑盐面积、斑盐数量均有所减少，以罗布麻叶总黄酮高剂量组改善最明显。

图 1

注：A：对照组；B：模型组；C：阳性对照组；D、E、F：罗布麻叶低、中、高剂量组。 图 1 罗布麻叶总黄酮对AS大鼠胸主动脉组织病理学影响(HE，×200)

对照组大鼠胸主动脉内膜、中膜和外膜分界清楚，内膜血管内皮细胞完整，中膜可见梭形平滑肌细胞，弹力纤维层结构清晰完整，外膜为结缔组织(图 1A)；模型组大鼠胸主动脉内膜局部增厚，出现炎性细胞浸润及泡沫样细胞，弹力纤维发生断裂和崩解，中膜萎缩，局部出现钙化灶(图 1B)；阳性对照组(图 1C)及罗布麻叶总黄酮中、高剂量组(图 1E、F)大鼠胸主动脉病理变化较模型组有所减轻，仅于内膜下见少量炎细胞浸润及泡沫细胞的浸润，中膜钙灶明显减少；罗布麻叶总黄酮低浓度组改善不明显(图 1D)。

表 2

表 2 罗布麻叶总黄酮对AS大鼠血脂指标及AS指数影响(n=12，x±s) 组别 TG (mol/L) TC (mol/L) LDL-C (mol/L) HDL-C (mol/L) AS指数 对照组 0.111±0.018 1.485±0.176 0.615±0.071 0.387±0.073 2.943±0.750 模型组 0.329±0.028a 5.000±0.658a 3.469±0.640a 0.159±0.047a 30.598±7.911a 阳性药对照组 0.212±0.034ab 3.203±0.205ab 1.609±0.363ab 0.279±0.041ab 10.709±1.924ab 罗布麻叶组 25 0.306±0.059a 3.889±0.619ab 2.972±0.661a 0.203±0.031ab 18.497±3.878ab 50 0.223±0.039ab 3.427±0.848ab 2.289±0.267ab 0.269±0.054ab 11.927±3.592ab 100 0.219±0.043ab 2.839±0.739ab 1.856±0.471ab 0.297±0.044ab 8.619±2.408ab 注：与对照组比较，a P＜0.05；与模型组比较，b P＜0.05。

表 2 罗布麻叶总黄酮对AS大鼠血脂指标及AS指数影响(n=12，x±s)

与对照组比较，模型组大鼠血清中TG、TC、LDL-C水平及AS指数均明显升高，而HDL-C水平则降低(P＜0.05)；与模型组比较，阳性对照组及罗布麻叶中、高剂量组均不同程度降低大鼠血清中TG、TC、LDL-C水平及AS指数，提高HDL-C水平，差异具有统计学意义(P < 0.05)。

表 3

表 3 罗布麻叶总黄酮对各组大鼠SOD、MDA影响(n=12，x±s) 组别 SOD (U/mL) 丙二醛(nmol/mL) 对照组 108.33±20.83 4.47±2.73 模型组 52.63±22.64ab 10.62±6.86a 阳性药对照组 71.43±26.32ab 6.33±1.77ab 罗布麻叶组 25 53.22±18.65a 9.59±1.38a 50 65.73±28.66ab 7.36±1.36ab 100 74.33±23.67ab 6.08±3.24ab 注：与对照组比较，a P＜0.05；与模型组比较，b P＜0.05。

表 3 罗布麻叶总黄酮对各组大鼠SOD、MDA影响(n=12，x±s)

与对照组比较，模型组大鼠血清中SOD酶活力下降、丙二醛含量升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；与模型组比较，阳性对照组及罗布麻叶中、高剂量组大鼠血清中SOD活力升高，丙二醛含量降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。

AS的发生是多种因素和作用环节介导的慢性病理变化过程，血管内皮细胞损伤是AS发生的始动环节，脂质过氧化是细胞损伤的重要机制。研究表明，血钙升高，破坏动脉管壁内皮的完整性，有利于血浆脂质对管壁内皮浸入和损伤，可以促进AS的形成^[10]。Joris等^[11]研究表明，大鼠用高胆固醇饲料喂饲1年后可形成典型的AS病变，经光镜和电镜证实，病变形成过程与人类相似。目前，常见的动物模型有家兔、大鼠、鹌鹑等，家兔的优点是对外源性胆固醇吸收率高，采血、饲养和管理方便；但其动脉斑块形成时间久，且抵抗力低，易继发感染。鹌鹑的优点是体型小，抵病力强，药品消耗少，但是其仅与人类早期粥样斑块类似^[7]。研究表明对于Wistar大鼠复制的AS模型，在传统的高脂饲料中添加丙硫氧嘧啶、胆酸钠及白糖，抑制甲状腺功能、促进胆固醇吸收，同时能改善丙硫氧嘧啶的苦味；通过腹腔注射vitamin D3 (VD₃)(共70 U/kg)作为钙离子诱导剂，引起动脉钙超负荷^[7-9]。本研究结果显示，VD₃联合高脂饲料能导致大鼠血清中TG、TC、及LDL含量升高，AS指数明显升高；大鼠主动脉脂质沉积面积增大，胸主动脉内膜下出现明显的钙化、炎细胞浸润、血管平滑肌细胞增生及泡沫样细胞，弹力纤维发生变性、断裂和崩解，中膜萎缩等变化，为典型AS病理变化。提示，成功复制大鼠AS模型。

黄酮类化合物是一类广泛分布于自然界的重要天然化合物。近年研究表明，黄酮类化合物具有多种生物活性，如降低血管脆性及异常的通透性，扩张冠状动脉、抗血小板凝集、抗自由基氧化等作用。黄酮类化合物对动脉粥样硬化具有一定的治疗作用^[12]；黄芪总黄酮可减少AS斑块面积，降低TG、TC水平，从而改善AS^[13]；大豆异黄酮通过抑制和AS有关的炎性因子活性，从而改善AS的发展^[14]；藤茶总黄酮可显著降低AS大鼠的血脂^[15]，改善AS的发展。本研究结果显示，罗布麻叶中、高剂量组大鼠胸主动脉脂质沉积面积均明显减少，主动脉仅于内膜下见少量炎细胞及泡沫细胞浸润，中膜钙灶明显减少；大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平明显降低，HDL-C水平升高，AS指数明显降低(AS形成的危险性减小)。提示，罗布麻叶总黄酮可能通过减少外源性脂质吸收，抑制胆固醇合成，促进脂质的转运和清除，加速其排泄等多种途径调节脂质代谢，降低血脂水平，达到其防治AS的目的^[16]。

SOD是体内清除自由基的重要抗氧化酶，催化O^-2歧化为H₂和O₂，降低机体的脂质过氧化反应，对机体的氧化与抗氧化平衡起着重要作用^[17]。丙二醛为氧自由基氧化细胞膜上磷脂形成的脂质过氧化物的稳定存在形式，可反映机体内脂质过氧化程度。本研究结果显示，中、高剂量罗布麻叶总黄酮能明显降低AS大鼠血清中MDA含量、提高SOD活力。提示，罗布麻叶总黄酮对大鼠AS胸主动脉损伤、抗氧化作用及血脂异常的改善作用，可能与降低脂质过氧化物水平，提高机体抗氧化能力有关。