慈菇，又称剪刀草、燕尾草、蔬卵，属泽泻科，是一种药食兼用的天然抗氧化食物，盛产于中国南方山区，如福建闽西连城、上杭一带。研究显示，慈菇多糖能够提高小鼠的胸腺指数、脾脏指数及小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力^[1]，本研究通过观察不同剂量慈菇多糖对小鼠巨噬细胞增殖影响，探讨慈菇多糖提高巨噬细胞功能的可能机制，结果报告如下。

慈菇多糖，纯度73.81%，由福建省环境与健康研究所提供(经水提醇沉法、二乙氨乙基纤维素色谱柱提纯获得)；香菇多糖(山东振东泰盛制药有限公司，规格：1 mg/支)；DMEM高糖培养基(美国Hyclone公司)；胰蛋白酶、双抗(链、青霉素)(美国Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；二甲基亚砜(厦门鹭隆生物科技发展有限公司)；小鼠白细胞介素2(interleukin-2，IL-2)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α) ELISA试剂盒(上海蓝基生物科技有限公司)；去DNA逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq荧光定量试剂盒(日本TaKaRa公司)；Trizol Reagent (美国Invitrogen公司)；哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)抗体(兔抗鼠)、第10染色体缺失与张力蛋白同源磷酸酶基因(phosphatase and tensin homologdeleted on chromosome ten，PTEN)抗体(兔抗鼠)(美国Cell Signaling Technology公司)；兔抗鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体(英国Abcam公司)。CK40-F200 BH-2倒置显微镜(日本Olympus公司)；GeneAmp PCR System 2400(美国Foster City公司)；Lighter 480型荧光定量PCR仪(美国Roche公司)；垂直电泳槽、电泳仪、半干电转仪(美国Bio-Rad公司)；Odyssey SA近红外双色激光成像系统(美国LI-COR公司)。

小鼠巨噬细胞RAW 264.7(中科院上海细胞库)，小鼠巨噬细胞RAW 264.7以含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基(含100 IU/mL青霉素和100 IU/mL链霉素)，37 ℃、5%CO₂环境培养，取对数生长期细胞进行实验。

以5.6×10⁴个/孔密度将细胞接种于96孔板，实验设慈菇多糖5、50、500、5 000 μg/mL剂量组，每组5个复孔，同时设对照组(未加慈菇多糖干预物)和培养液空白组；作用12、24、36 h后，加入20 μL噻唑蓝[3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide，MTT](5 g/L)，于37 ℃、5%CO₂培养箱孵育4 h，每孔加100 μL二甲基亚砜，轻震10 min，酶标仪550 nm波长检测吸光度(A)值，计算细胞增值率，细胞增值率=(实验组A值-对照组A值)/对照组A值×100%。

取对数生长期细胞以2×10⁶个/孔接种于6孔板，实验设对照组、慈菇多糖低、中、高剂量组(5、50、500 μg/mL)和香菇多糖组(100 μg/mL)，每组3个复孔；铺板24 h后分别给予无血清DMEM、慈菇多糖、香菇多糖，于37 ℃、5%CO₂培养箱孵育12 h后，观察细胞形态；吸取上清液，测定细胞因子IL-2、TNF-α分泌水平；裂解细胞，按试剂盒说明书测定细胞内NO含量。

引物设计与合成由上海生工生物工程有限公司完成。引物序列如下：β-actin上游：5′-AAATCG-TGCGTGACATCAAAGA-3′，下游：5′-GGCCATC-TCCTGCTCGAA-3′；mTOR上游：5′-CCGCATCATTCACCCAATAGTTC-3′，下游：5′-CGCACGAGGACTTTATTCACCA-3′；PTEN上游：5′-AGACCATA-ACCCACCACAGC-3′，下游：5′-TACACCAGT-CCGTCCCTTTC-3′。取对数生长期细胞以2×10⁶个/孔接种于6孔板，分组与处理方法同1.3.2；各组于37 ℃、5%CO₂培养箱干预12 h，抽提总RNA，参照逆转录试剂盒操作进行cDNA合成(37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，-4 ℃冷却，-20 ℃保存)；Real time PCR反应条件：95 ℃ 30 s循环1次，95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s循环40次。采用β-actin基因作为内对照，应用实时荧光定量PCR检测各组细胞mTOR、PTEN基因表达，每组3个复孔，取平均值。

采用Western blot法，取对数生长期细胞以2×10⁶个/孔接种于6孔板，分组与处理方法同1.3.2；于37 ℃、5%CO₂培养箱干预12 h后提取蛋白；配制分离胶和浓缩胶；蛋白样品沸水煮5~10 min致蛋白变性，上样；浓缩胶80 V、分离胶100 V电泳分离；硝酸纤维素膜转膜，封闭；加入封闭液稀释的一抗，孵育1.5 h；TBST缓冲液洗膜；加入TBST缓冲液稀释的二抗，孵育3 h；TBST缓冲液洗膜；Odyssey红外成像仪800通道检测mTOR、PTEN蛋白表达水平。

数据采用x±s表示，应用SPSS 18.0软件进行统计分析，多组间均数比较采用单因素方差分析、组间两两比较采用最小显著差法(方差齐性)和Dunnett T3(方差不齐)，检验水准α=0.05。

表 1

表 1 慈菇多糖对RAW 264.7细胞增值率影响(%，x±s，n=5) 组别(μg/mL) 培养时间(h) 12 24 36 对照组 0.029±3.097 0.002±3.557 0.017±3.955 慈菇多糖 5 11.780±4.123 19.300±4.447ab 18.066±5.535a 50 59.595±6.743a 52.808±7.959ab 32.791±6.891ab 500 79.450±5.232a 71.636±6.791ab 76.183±5.195ab 5 000 57.236±5.625a 62.082±6.492ab 52.621±4.982ab 注：与对照组比较，a P < 0.05；与12 h比较，b P < 0.05。

表 1 慈菇多糖对RAW 264.7细胞增值率影响(%，x±s，n=5)

对照组细胞呈圆形或椭圆形，贴壁良好，突起较少，而慈菇多糖干预后细胞数目增加，体积明显增大，呈现菱形、梭形或不规则形，可见较长伪足，以50~500 μg/mL剂量组、干预12 h最为显著；与对照组比较，各慈姑多糖干预组RAW 264.7细胞增殖率明显升高(F=95.157，P < 0.01)、不同干预时间各组RAW 264.7细胞增殖率差异明显(F=43.946，P < 0.01)；以500 μg/mL慈菇多糖干预12 h，RAW 264.7细胞增殖率最高。

表 2

表 2 慈菇多糖对RAW264.7细胞因子水平影响(x±s，n=3) 组别(μg/mL) IL-2(pg/mL) TNF-α(pg/mL) NO (μmol/L) 对照组 50.661±5.006 23.788±4.093 2.950±0.723 慈菇多糖 5 68.216±1.609a 29.546±3.506 4.264±0.875 50 70.850±6.669a 46.989±7.895a 3.957±0.992 500 89.634±8.399a 70.739±7.452a 7.199±1.242a 香菇多糖 100 84.367±8.165a 48.125±6.757a 3.563±0.732 注：与对照组比较，a P < 0.05。

表 2 慈菇多糖对RAW264.7细胞因子水平影响(x±s，n=3)

与对照组比较，慈菇多糖低、中、高剂量组及香菇多糖组RAW 264.7细胞内IL-2水平升高，慈菇多糖中、高剂量组及香菇多糖组RAW 264.7细胞内TNF-α水平升高，慈菇多糖高剂量组RAW 264.7细胞内NO水平升高，差异有统计学意义(P < 0.01)。

表 3

表 3 慈菇多糖对RAW 264.7 mTOR、PTEN mRNA表达影响(x±s，n=3) 组别(μg/mL) mTOR PTEN 对照组 1.000±0.000 1.000±0.000 慈菇多糖 5 0.695±0.127 0.478±0.143 50 0.578±0.173a 0.647±0.115 500 0.391±0.165a 0.284±0.055a 香菇多糖 100 1.168±0.322 0.603±0.359 注：与对照组比较，a P < 0.05。

表 3 慈菇多糖对RAW 264.7 mTOR、PTEN mRNA表达影响(x±s，n=3)

与对照组比较，慈菇多糖中、高剂量组RAW 264.7细胞内mTOR mRNA表达降低，慈菇多糖高剂量组RAW 264.7细胞内PTEN mRNA表达降低，差异有统计学意义(P < 0.05)。

图 1

注：1：对照组；2~4：慈菇多糖低、中、高剂量组；5：香菇多糖组。 图 1 慈菇多糖对RAW 264.7细胞mTOR、PTEN蛋白表达影响

结果显示，慈菇多糖干预12 h后，对照组, 慈菇多糖低、中、高剂量组, 香菇多糖组RAW 264.7细胞内mTOR蛋白表达水平分别为(2.618±0.134)、(2.485±0.178)、(2.354±0.316)、(1.925±0.287)、(2.223±0.015)；与对照组比较，慈菇多糖高剂量组、香菇多糖组RAW 264.7细胞内mTOR蛋白表达降低(P < 0.05)。对照组，慈菇多糖低、中、高剂量组，香菇多糖组RAW 264.7细胞内PTEN蛋白表达水平分别为(1.168±0.135)，(0.780±0.213)、(1.159±0.354)、(1.138±0.106)，(0.751±0.274)；各组间无明显差异。

研究发现，多糖类免疫应答调节剂(biological responsemodifier，BRM)与巨噬细胞(MF)等免疫细胞表面模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)结合启动免疫应答^[2]。多糖类BRM与MF等免疫细胞的表面多糖受体结合，激活细胞的信号转导途径，增强MF的免疫功能并促使IL-1、TNF-α、NO等细胞因子的分泌增加。这些免疫活性分子作为细胞间相互作用的内源性信号，继发地诱导产生其他细胞因子，如IL-2、IL-6、IL-8、IL-12，并对机体的免役应答起到重要的调节作用^[3-4]。本研究结果显示，与对照组比较，慈菇多糖各剂量组RAW 264.7细胞内IL-2、TNF-α、NO含量升高，且慈菇多糖高剂量组RAW 264.7细胞内TNF-α、NO浓度高于香菇多糖组。提示慈菇多糖具有促进巨噬细胞产生细胞因子的能力，且在一定条件下效果优于香菇多糖。

mTOR的主要生物学作用为调控细胞生长和蛋白质合成、细胞运动、细胞自噬、调节免疫、影响肿瘤发生、控制能量代谢^[5]。在免疫系统中，mTOR信号对维持免疫稳态起重要作用。无论是天然免疫细胞(如中性粒细胞、肥大细胞、巨噬细胞、树突状细胞)的存活迁移及炎症因子分泌^[6-7]，还是适应性免疫细胞(如T细胞)的分化决定均离不开mTOR信号调节^[8-10]。本研究结果显示，慈菇多糖中、高剂量组RAW 264.7细胞的mTOR mRNA基因表达下降，慈菇多糖高剂量组、香菇多糖组mTOR蛋白表达也显著低于对照组。PTEN蛋白表达(位于PI3K/PTEN/Akt/mTOR信号通路上)未见改变，仅慈菇多糖高剂量组PTEN mRNA表达有所下降，提示慈菇多糖提高免疫功能机制可能与PI3K/PTEN/Akt/mTOR有关。