由于大气污染日益严重以及广谱抗菌药物、免疫抑制剂等的应用，侵袭性曲霉菌病(invasive Aspergillosis,IA)呈上升趋势^[1-2]。由于缺乏特异的临床依据，IA诊断困难，死亡率高^[3-4]，早期明确诊断是解决IA的关键^[3-5]。半乳甘露聚糖(galactomannan,GM)是曲霉菌细胞壁多糖蛋白，在宿主内侵袭生长及体外培养时均可释放^[5-6]。IA患者的血清等体液中存在曲霉菌GM，有效检出GM是IA早期诊断的研究热点^[5-7]。本研究利用噬菌体展示技术，构建鼠源抗烟曲霉GM的单链抗体(single chain antibody,scFV)库，富集、筛选结合GM的特异性scFv，为制备曲霉菌特异性抗体提供新的方法，有利于进行呼吸道烟曲霉菌的检出。

烟曲霉菌GM的制备及纯化参考Latgé JP等^[8]的方法，烟曲霉菌株293培养滤液经乙醇沉淀，沉淀部分经洗涤后，重悬于水中并冻干。可沉淀部分重悬起后经阴离子交换层析进一步纯化GM,其纯度经质谱法分析测定，分析测定由美国University of Georgia测试中心完成(报告编号：XL100510)。以纯化GM为免疫原对4～5周龄BALB/C雌鼠(SCXK 京-2010-0002，北京维通利华公司)进行免疫接种,首免后1周按同剂量进行第2次免疫，再隔10 d加倍剂量进行第3次免疫。用ELISA方法检测抗体效价。

取3只免疫小鼠脾脏混合，提取总RNA，RT-PCR扩增可变区片段。PCR 反应程序为：97 ℃预变性2 min，继以94 ℃变性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共32个循环。取5 μL PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳观察。以扩增得到的VH和VL DNA片段为模板，经重叠扩增PCR合成VH-连接序列-VL片段(scFv)。

scFv突变克隆噬菌体展示文库的构建scFv产物连接到载体pCANTAB 5E上 酶切位点Sfi I和Not I之间，电转化到感受态大肠杆菌TG1。得到的完整噬菌体scFv文库加入甘油冻存。取一小部分悬于10 mL 2×YTAG培养基(OD₆₀₀＝0.8)，加入8×10¹¹pfu的辅助性噬菌体M13KO7，37 ℃温育90 min，离心并以15 mL 2×YTAK重新悬细胞，37 ℃培养6 h，离心收集上清，加入1/5体积的PEG/NaCl溶液以沉淀噬菌体。冰浴30 min以上，10 000 r/min 4 ℃离心20 min，以2 mL含1%BSA的PBS重悬沉淀，13 000 r/min离心5 min得到的上清即为噬菌体scFv表达展示文库。

以纯化的曲霉菌GM 10~100 μg/mL包被Nunc免疫反应试管，经PBS洗涤，加入1 mL含2%脱脂奶的PBS静置30 min(以下操作均在室温下进行)。加入300 μL scFv文库噬菌体上清(滴度约2×10¹¹pfu)，放置90 min，PBST(含0.05% Tween 20的PBS)洗15次后离心沉淀细胞后加入500 μL洗脱液(0.1 mol/L甘氨酸/HCl，pH=2.5，含0.1%牛血清白蛋白BSA)，加入2 mol/L的Tris-HCl中和溶液pH值。洗脱下来的噬菌体加到 5mL对数生长期的TG1菌液中，37 ℃静止感染30 min后，取一定量涂2×YTAG，平板测定所洗脱下来的噬菌体滴度(cfu)。进行四轮吸附-洗脱-富集的生物筛选。

每轮生物筛选中，对从曲霉菌GM包被免疫试管上洗脱下来的噬菌体颗粒进行滴度测定，洗脱判断下来的噬菌体量逐渐升高，是否有特异性的富集。

经过4轮生物筛选后，随机挑取平板上的文库单个克隆提取质粒，并对其所携带的VH和VL片段部分进行基因测序分析。

单个克隆phage-ELISA：随机挑取筛选4轮后的90个单个克隆，按前述方法获得在噬菌体表面展示有ScFv的单个克隆的噬菌体抗体上清，直接用于细胞ELISA检测；细胞ELISA(室温下操作)：以100 μg/mL曲霉菌GM 100 μL/孔包被96孔酶标板，2%脱脂奶的PBS阻断后，加入单个克隆的噬菌体抗体上清(2～3)×10⁹ /孔，孵育2 h，PBST洗涤8次后用HRP-抗M13抗体(美国GE Healthcare Life Sciences公司)检测结合的噬菌体颗粒，四氨基联苯胺为底物，显色8 min，测定450 nm的光吸收值(A₄₅₀)。阴性对照以胎牛血清BSA作为抗原，特异性对照以白假丝酵母菌培养滤液经乙醇沉淀粗提物作为抗原(方法同上)，包被到96孔酶标板，进行与上述相同实验操作。

采用SAS 8.1统计分析软件进行数据分析。考察的主要指标为曲霉菌GM、BSA及白假丝酵母菌多糖分泌抗原分别包被酶标板与90个克隆的噬菌体抗体进行ELISA反应，测定光吸收值(A₄₅₀)；组间比较采用χ²检验，显著性水准α=0.05；两两比较采用χ²检验，显著性水准α=0.05。

提取小鼠脾脏总RNA，RT-PCR扩增VH和VL片段，于1.5%琼脂糖凝胶电泳分别可见约430 bp和350 bp的DNA片段。以PCR方法从总RNA中经多次反应获得VH和VL 的 DNA片段为模版，经重叠PCR扩增得到单链抗体可变区基因片段(scFv)，产物大小约为780 bp。

图 1

注：Lane1：VL片段；Lane2：VH片段；Lane3：重叠PCR扩增scFv基因片段；M1:100 bp DNA marker；M2:1kb DNA marker。 图 1 VH和VL基因的扩增及重叠PCR扩增结果

将scFv基因克隆到噬菌粒载体pCANTAB 5E，电转化感受态大肠杆菌TG1，辅助噬菌体M13KO7超感染得到上清液即为噬菌体抗体库。梯度稀释法测得噬菌体库库容约为1.8×10⁷，噬菌体滴度为10¹²cfu。在感染辅助性噬菌体M13KO7救助下，可以于噬菌体表面表达重组的scFv抗体融合蛋白，经过PEG沉淀去除噬菌体，所得的上清为噬菌体表达文库。

以曲霉菌GM做为固相抗原包被免疫试管，进行4轮吸附-洗脱-富集的生物筛选，显示洗脱下来的噬菌体量逐渐升高，提示GM在淘选过程中能有效富集单链抗体。

表 1

表 1 scFv噬菌体抗体库的富增结果 淘筛人数 加入的噬菌体(cfu) 洗脱的噬菌体(cfu) 1 2.4×1011 2.10×103 2 2.2×1011 4.00×104 3 1.2×1011 1.80×104 4 1.2×1011 1.18×105

表 1 scFv噬菌体抗体库的富增结果

随机检测20个克隆，基因测序显示，E.coli TG1中转化DNA与预期相符，呈现多样性。抗体重链各区域组合正确，VH和VL之间有柔性多肽编码基因相连。提示单链抗体库的容量和多样性满足后续筛选分离目的基因的需要。

用曲霉菌GM和BSA、白假丝酵母菌多糖分泌抗原分别包被酶标板，与90个克隆的噬菌体抗体进行ELISA检测，结果显示，6个克隆呈现GM的特异性结合，其中2个克隆4C2和3D3特异性结合较强。

表 2

表 2 scFv噬菌体抗体克隆于曲霉菌特异性结合结果 分组 样本量 x±s 克隆 3G2 5 0.121±0.003 2 1A7 5 0.128±0.001 0 1G4 5 0.180±0.053 1 6D2 5 0.248±0.001 5 4C2 5 0.606±0.005 2 3D3 5 0.724±0.002 1 对照 空白 5 0.058±0.003 8 BSA 5 0.062±0.004 9 白假丝酵母 5 0.074±0.002 9

表 2 scFv噬菌体抗体克隆于曲霉菌特异性结合结果

本研究采用噬菌体展示技术构建的scFv抗体库，具有传统的杂交瘤抗体制备技术所无法比拟的优越性^[9]。通过载体将目的基因引入大肠杆菌菌中进行表达，操作简便，能够快速、有效的筛选到针对纯化的烟曲霉GM抗原分子的抗体片段。同时，scFv分子量小，仅仅保留了与抗原分子特异性结合的抗体可变区部分，最大程度的降低了鼠源性的成分，以避免人抗鼠源抗体的反应。以往认为侵袭性曲霉菌病主要发生在免疫抑制人群。急性白血病、骨髓移植、实体器官移植、糖皮质激素应用，糖尿病以及艾滋病均为侵袭性曲霉菌感染的危险因素^{[3-4, 10]}。随着抗肿瘤治疗的进步、器官移植的普及，多种临床有创操作包括大型呼吸机等的使用，使得深部真菌感染在院内感染范畴中所占的比例越来越重要，烟曲霉菌在临床深部真菌感染中的地位日益重要，其发生率明显增高。最近研究显示，健康成人大量接触曲霉菌孢子时，如接触发霉的干草、树皮碎片，溺水或吸入蘑菇种植区的粉尘，也会导致 IA 的发生^[10-12]。IA的发病率逐年上升，因为缺乏特异的临床表现，仅仅依赖分离培养和组织活检这些金标准诊断，往往会延误了治疗，患病后的死亡率高达50%~90%^{[10, 13-14]}。因此早期诊断及时开展治疗，包括抢先治疗是临床解决IA感染的关键。而曲霉菌GM可能做为IA的生物标志物，在早期诊断方法的研究中成为热点^{[10, 15-16]}。因此，制备、筛选高亲和性的抗曲霉菌GM抗体分子，并且有效的检出曲霉菌GM，对于IA早期明确诊断有重要意义。曲霉菌GM属于多糖蛋白类抗原，国内外文献报道中关于制备针对多糖类抗原的基因工程抗体的制备比较少^[17-18]。我们在对构建的单链抗体库的筛选过程中，用渐次增强的洗涤条件以期提高特异性噬菌体抗体的富集效率，经4轮淘筛后，洗脱的噬菌体滴度的渐增提示利用纯化的曲霉菌GM的淘筛筛选过程是有效的。随机挑选出4轮筛选后的20个克隆，进行可变区基因序列分析，证实了单链抗体库中VH和VL区的多样性。Phage-ELISA结果显示，随机挑选出4轮筛选后的90个克隆，结果其中6个克隆能够特异性检测曲霉菌GM，而与对照的BSA、白假丝酵母菌分泌多糖抗原无结合反应。提示构建的抗体库中可以筛选获得用于曲霉菌 GM特异性结合scFv克隆。本研究构建并初步鉴定了曲霉菌GM鼠源scFv噬菌体抗体库，构建的抗体库可变区片段连接率较高，多样性较好。可以快速、简便地获得特异性小分子抗体，可用于进一步制备曲霉菌GM高特异性抗体。同时也为开发GM抗体诊断试剂奠定了研究基础，从而更有利于进行IA的早期诊断。

由于烟曲霉菌的孢子主要是通过呼吸道吸入而进入患者体内，曲霉菌感染的部位主要在肺部，约占曲霉菌感染的90%。由于其诊断方法有限和临床表现缺乏特异性，从而导致诊断困难^{[5, 19]}。scFv分子分子量小，组织穿透力强，体内清除快，不易与具有Fc受体的非靶细胞结合^[16-18]。此外scFv还可与毒素、放射性同位素、细胞因子等效应分子构建成多种双功能抗体分子。应用曲霉菌GM直接筛选噬菌体展示ScFv抗体文库，经phage-ELISA得到阳性克隆，这些结果将为进一步构建针对GM的双功能抗体分子奠定基础，并有可能为研究肺曲霉菌定位诊断提供有价值的依据。