2016, Vol. 32
表 1
没食子酸抗实验性肝纤维化作用机制
引用本文
赵川, 李俊萱, 陈山琼, 韦燕飞. 没食子酸抗实验性肝纤维化作用机制[J]. 中国公共卫生, 2016, 32(11): 1498-1501.
ZHAO Chuan, LI Jun-xuan, CHEN Shan-qiong, et al. Effect of gallic acid on experimental liver fibrosis in rats[J]. Chinese Journal of Public Health, 2016, 32(11): 1498-1501.
没食子酸抗实验性肝纤维化作用机制
广西中医药大学基础医学院生理教研室, 广西 南宁 530001
摘要:
目的
探讨中药单体没食子酸对四氯化碳（CCl4）诱导的大鼠肝纤维化影响及其机制。
方法
采用CCl4制备大鼠肝纤维化模型，观察没食子酸对大鼠肝功能、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、L-羟脯氨酸（Hyp）、血清透明质酸（HA）、层粘连蛋白（LN）、Ⅲ型前胶原（HPCⅢ）含量影响，观察肝脏显微结构变化。
结果
与对照组比较，模型组大鼠血清中谷丙转氨酶（ALT）[（342.07±28.03）U/L]、谷草转氨酶（AST）[（532.88±115.55）U/L]、MDA含量[（35.07±11.43）nmol/mL]升高，SOD活力[（147.18±32.27）U/mL]下降，血清中Hyp、HA、LN及HPCⅢ含量[分别为（49.23±10.87）μg/mL、（161.82±35.24）ng/mL、（46.90±24.52）ng/L、（8.47±1.10）ng/mL]明显升高（P<0.01）；与模型组比较，高剂量没食子酸组大鼠血清中ALT、AST活力[分别为（280.63±119.50）、（229.82±51.22）U/L]明显下降，MDA含量[（10.32±3.88）nmol/mL]下降、SOD活力[（230.30±17.56）U/mL]升高，血清中Hyp、HA、LN及HPCⅢ含量[分别为（26.83±8.23）μg/mL、（103.26±7.16）ng/mL、（11.74±3.69）ng/L、（6.00±0.53）ng/mL]明显下降（P<0.05）；病理切片结果表明，没食子酸对CCl4所致大鼠肝纤维化有明显改善作用。
结论
没食子酸具有明显的保肝、抗肝纤维化作用，其机制可能与其提高机体抗氧化能力有关。
关键词：
没食子酸
肝纤维化
大鼠
抗氧化
Effect of gallic acid on experimental liver fibrosis in rats
Department of Physiology, College of Basic Medical Science, Guangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanning, Guangxi Zhuang Autonomous Region 530003, China
Abstract:
Objective
To explore the effect of gallic acid (GA) on carbon tetrachloride (CCl4)-induced hepatic fibrosis in rats and its mechanism.
Methods
The rat hepatic fibrosis model was established with CCl4,and then the rats were treated witn GA.The changes in hepatic function,blood hyaluronic acid (HA),superoxide dismutes (SOD),malondialdehyde (MDA),L-hydroxyproline (Hyp),serum HA,laminin (LN),and procollagen type Ⅲ (HPCⅢ)were detected and the changes in microstructure of hepatic tissues were also observed.
Results
Compared with those of the normal control group,the serum alanine transaminase (ALT)(342.07±28.03 U/L),aspartate aminotransferase (AST)(532.88±115.55 U/L),MDA (35.07±11.43 nmol/mL),Hyp (49.23±10.87μg/mL),HA (161.82±35.24 ng/mL),LN (46.90±24.52 ng/L),and HPCⅢ (8.47±1.10 ng/mL)of the model group were increased significantly (P<0.01 for all);while the serum SOD (147.18±32.27 U/mL)] was decreased (P<0.01).Compared with those of the model control group,the ALT (280.63±119.50 U/L),AST (229.82±51.22 U/L),MDA (10.32±3.88 nmol/mL),Hyp (26.83±8.23μg/mL),HA (103.26±7.16 ng/mL),LN (11.74±3.69 ng/L),] and HPCⅢ (6.00±0.53 ng/mL) of the high dose GA group were decreased significantly (P<0.01 for all);while the activity of SOD (230.30±17.56 U/mL) was increased (P<0.01).The pathological observation revealed that GA could improve injuries of hepatic tissues.
Conclusion
GA has the effects of protecting liver and anti-liver fibrosis and the mechanism of the effects may be related to its anti-oxidation role.
Key words:
gallic acid
hepatic fibrosis
rat
anti-oxidation
没食子酸(gallic acid，GA)，化学名称为3，4，5-三羟基苯甲酸，又名五倍子酸，棓酸，是一种多酚类化合物，是自然界分布很广的一种有机酸。具有抗肿瘤、抗艾滋病、抗炎、抗氧化、杀锥虫、保护心血管等作用[1]。有研究表明没食子酸对二甲基亚硝胺所致的急性肝损伤具有一定的保护作用[2]。本研究通过建立四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)诱导的大鼠肝纤维化模型，探讨没食子酸在慢性肝损伤和肝纤维化中的干预作用及可能机制。结果报告如下。
1 材料与方法 1.1 实验动物健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，specific pathogen-free(SPF)级，体重160~200 g，由广西医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(桂)2014-0002号；饲料由广西医科大学实验动物中心提供。大鼠分笼饲养，室温20~25℃，相对湿度40%~70%，自由饮食饮水。
1.2 主要试剂与仪器没食子酸(上海源叶生物科技公司)，没食子酸用时以0.5%羧甲基纤维素钠(carboxymethylcellulose sodium,CMC-Na)混悬；谷丙转氨酶(alanine transaminase，ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase，AST)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、L-羟脯氨酸(L-hydroxyproline，Hyp)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；层粘连蛋白(laminin，LN)试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；透明质酸(hyaluronic acid，HA)、Ⅲ 型前胶原(procollagen type III，HPCIII)试剂盒(武汉华美生物工程有限公司)；CCl4(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司)。酶标仪(瑞士Tecan Infinite M200 PRO公司)；光学显微镜(日本Olympus BX60公司)。
1.3 分组与处理取大鼠50只，适应性喂养1周后，随机分成5组：对照组、模型组、没食子酸高、中、低剂量组(100、50、25 mg/kg)；除对照组外，其余大鼠首次均以40% CCl4油溶液5 mL/kg背部皮下注射造模，之后每次注射量为3 mL/kg，2次/周，连续9周，造模期间以10% 乙醇作为大鼠的唯一饮水；对照组自来水自由喂养；各组均以普通饲料喂养。造模同时没食子酸高、中、低剂量组分别给予不同浓度没食子酸溶液(100、50、25 mg/kg)，模型组给予生理盐水灌胃，1次/d，连续9周。末次给药后禁食12 h，3%戊巴比妥钠2 mL/kg腹腔注射麻醉，腹主动脉采血，25 ℃放置2 h后以4 ℃ 3 000 r/min离心5 min，分离血清，3~5 ℃放置待检。
1.4 指标与方法 1.4.1 肝指数测定肝指数=肝重/体重×100%。
1.4.2 血清指标测定大鼠血清中AST、ALT活性测定采用赖氏法；大鼠血清中Hyp含量测定采用碱水解法；大鼠血清中LN、HA、HPCIII含量测定采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)，SOD活性测定采用黄嘌呤氧化酶法；MDA含量检测采用改进硫代巴比妥(thiobarbituric acid reaction,TBA)法；操作按试剂盒说明书进行。
1.4.3 肝脏病理学检查取大鼠肝脏同一部位组织，以4%多聚甲醛固定，脱水，透明，石蜡包埋，石蜡切片，HE染色，封片。光学显微镜下观察，拍照。
1.5 统计分析数据均以x±s表示，采用SPSS 17.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用最小显著差法，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果 2.1 没食子酸对肝纤维化大鼠肝指数影响对照组、模型组、没食子酸高、中、低剂量组大鼠肝指数分别为(2.77±0.67)%、(4.74±0.95)%、(3.20±0.52)%、(3.24±0.38)%、(4.32±1.56)%；与对照组比较，模型组大鼠肝指数明显增大(P<0.01)；与模型组比较，没食子酸高、中剂量组大鼠肝指数明显减小(P<0.01)。
2.2 没食子酸对肝纤维化大鼠肝功能影响(表 1)结果显示，与对照组比较，模型组大鼠血清中AST、ALT活性明显升高(P<0.01)；与模型组比较，没食子酸各剂量组大鼠血清中AST、ALT活性均明显降低(P<0.05)。
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表 1 没食子酸对肝纤维化大鼠肝功能影响(U/L，xs) |
2.3 没食子酸对肝纤维化大鼠血清MDA、SOD影响(表 2)
结果显示，与对照组比较，模型组大鼠血清中MDA含量明显升高(P<0.01)，SOD活力明显下降(P<0.01)；与模型组比较，没食子酸各剂量组大鼠血清中MDA含量均明显降低(P<0.01)，SOD活力均升高(P<0.05)。
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表 2 GA对大鼠血清MDA含量及SOD活力影响(x±s) |
2.4 没食子酸对肝纤维化大鼠肝纤维化指标影响(表 3)
结果显示，与对照组比较，模型组大鼠血清中LN、HA、HPCIII、Hyp水平均明显升高(P<0.01)；与模型组比较，没食子酸各剂量组大鼠血清LN、HA、HPCIII、Hyp水平均明显降低(P<0.05)。
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表 3 没食子酸对大鼠肝纤维化指标影响(x±s) |
2.5 没食子酸对肝纤维化大鼠肝脏病理学影响(图 1)
对照组大鼠肝脏肝小叶结构完整，肝索排列整齐，肝细胞形态正常，无水变性和脂肪变性，未见坏死，汇管区无炎症细胞浸润(图 1A)；模型组大鼠肝脏肝小叶结构破坏，肝细胞弥漫大疱性、小疱性脂肪变性，纤维结缔组织明显增生破坏正常肝小叶结构，分割包绕肝细胞团形成假小叶，增生的纤维结缔组织中淋巴细胞、单核细胞浸润，小胆管增生，呈肝硬化组织图像(图 1B)；没食子酸组大鼠肝组织汇管区少量淋巴细胞、单核细胞浸润，纤维结缔组织轻度增生，部分汇管区增生的纤维结缔组织插入肝小叶内形成纤维间隔，呈轻度肝纤维化(图 1C、D、E)。
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图 1 没食子酸对肝纤维化大鼠肝脏病理结构影响(HE，×200) |
3 讨 论
没食子酸是一种天然产物，广泛存在于掌叶大黄、山茱萸、大叶桉、五倍子等植物中。研究证实，没食子酸药理活性广泛，作为有效的中药分子在抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化等方面具有广阔的药用开发前景[3]。有研究证明，没食子酸能通过抗氧化作用抑制小鼠红细胞的溶血活性、抑制小鼠脑、肾匀浆脂质过氧化作用[4]。没食子酸能降低慢性肝损伤大鼠的转氨酶水平，提高抗氧化酶(glutathione peroxidase，GSH-px)、SOD、catalase(CAT)活性[5]。
肝纤维化是各种慢性刺激，包括病毒、自身免疫性疾病、中毒、胆汁淤积和代谢性疾病等所致的炎症反应或肝损伤后组织修复过程中的反应，是各种慢性肝病向肝硬化发展的病理过程。其主要特征表现为以胶原为主要成分的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)各种成分增多，降解相对不足而过量沉积，肝脏发生组分的改变或重构，轻者称为纤维化，重者有肝小叶结构改建、假小叶及结节形成，称肝硬化[6]。氧化应激在CCl4诱导的肝纤维化中具有重要作用。CCl4通过脂质过氧化作用损伤肝脏，机体或细胞内产生的活性氧(reactive oxygen species,ROS)能引起肝细胞、Kupffer细胞、中性粒细胞等细胞的氧化损伤；另外，ROS可改变肝细胞膜和亚细胞器的结构从而使肝细胞产生炎症反应，并产生大量炎症介质及细胞因子，这些介质和因子的释放可增强CCl4诱导的肝损伤[7-8]。
肝损伤严重可诱导转氨酶AST、ALT释放进入循环系统，因此，AST、ALT可作为肝损伤的常规指标。血清中LN、HA、HPCIII、Hyp为ECM的必要成分，是反映肝纤维化活动程度的重要指标[9]。MDA是脂质过氧化最重要的产物之一，其含量可反映组织过氧化损伤的程度；SOD是超氧自由基清除因子，是抗氧化防御系统的关键酶，可抑制自由基介导的脂质过氧化反应[10]。本研究结果显示，模型组大鼠血清中AST、ALT水平明显升高、肝细胞受损严重，存在明显脂质过氧化现象，肝组织病理学观察可见纤维增生、肝细胞变性、坏死。提示，肝纤维化大鼠模型造模成功。本研究结果还显示，模型组大鼠肝脏中MDA含量升高、SOD活力下降，血清中LN、HA、HPCIII、Hyp水平明显升高；没食子酸组大鼠肝组织中MDA含量下降、而SOD活力升高，血清中AST、ALT及LN、HA、HPCIII、Hyp水平均明显下降；肝脏病理组织学观察结果也表明没食子酸可在一定程度改善CCl4诱导的肝纤维化。提示，没食子酸具有明显抗肝纤维化作用，其机制可能与其抗氧化、抗炎，减少胶原合成有关。
参考文献
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