2016, Vol. 32
邻苯二甲酸(2-乙基己基)酯[di-(2-ethylhexyl)phthalate，DEHP]是一种大量应用于各种塑料产品的邻苯二甲酸酯类(phthalic acid esters,PAEs)增塑剂，使人和野生动物不可避免地暴露于DEHP环境[1]。DEHP具有拟雌激素和抗雄激素活性，长期暴露可导致内分泌、生殖和神经系统功能紊乱而危害健康[2]。研究发现，围生期母体暴露于DEHP可损伤仔鼠空间学习记忆能力，并加剧其焦虑和抑郁样行为[3-4]，提示发育中的脑对DEHP很敏感。突触是介导神经元间信息传递的特殊部位，其结构和功能直接决定动物的神经行为。神经元的树突是形成突触后的关键成分，决定神经元的突触传递效率[5]，在学习记忆中发挥重要作用。研究表明，雌激素可通过促进海马和皮层的新树突棘和突触形成而调节突触可塑性[6-8]。本研究利用体外培养的新生大鼠海马神经元，探讨DEHP对神经元树突和突触形态发育的影响及其机制。
1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器SD大鼠乳鼠(浙江医学科学院实验动物中心)，许可证号：SCXK(浙)2014-0001；Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)培养基(美国Gibco Invitrogen公司)，胰蛋白酶、L-谷氨酰胺(美国Amresco公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程公司)，多聚赖氨酸(美国Sigma公司)，雌激素受体(ER)阻断剂ICI182,780(美国Tocris公司)，硝酸纤维素膜(武汉博士德公司)，β-actin一抗(美国Santa Cruz公司)，胞外调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)1/2、synapsin I(美国Cell signaling Technology公司)。Leica TCS-SP5激光共聚焦扫描显微镜(德国徕卡公司)，Meta Morph 软件(美国Molecular Devices公司)。
1.2 海马神经元原代培养海马神经元取自新生24 h内乳鼠海马组织，置于含5 mL预冷DMEM培养基的玻璃瓶内剪碎，移除培养基，加入0.125% 胰蛋白酶培养箱中37 ℃消化30 min，加入2倍胰酶体积含10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，1 000 r/min 4 ℃离心5 min。将神经细胞悬浮于含10% 胎牛血清的DMEM培养基，种植在35 mm培养皿内包被了多聚赖氨酸的玻片上(5 mm×5 mm)，用于形态学观测的细胞密度为(1~2)×104 cells/cm2；用于Western blot分析的细胞种植于包被了多聚赖氨酸的培养板内，细胞密度为2×105 cells/cm2。5% CO2 37 ℃孵育4 h后，换上含2% B27 和0.5 mmol/L L-谷氨酰胺的neurobasal培养基继续培养，每3 d半量换液1次，培养至第10天。
1.3 分组与处理海马神经元培养至第5天时，加入终浓度为0.01、0.10、1.00、10.00 μmol/L DEHP(此时树突棘尚未出现，树突丝是树突干上主要的突起)；对照组加入终浓度＜0.01%二甲基亚砜；DEHP暴露时间为5 d。17β雌二醇组(17β-estradiol,17β-E2终浓度0.01 μmol/L)，与DEHP一起处理细胞；雌激素受体阻断剂ICI组(ICI182,780终浓度5 μmol/L)预处理神经元30 min后，再加入DEHP染毒处理。台盼蓝分析，所有神经元成活率在92.7%~93.6%之间。
1.4 指标与方法 1.4.1 免疫细胞染色取处理后海马神经元，用预温的磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS；0.01 mmol/L，pH 7.4)漂洗3次后，4%多聚甲醛固定神经细胞20 min；加入0.3% Triton X-100通透细胞5 min，加入1% 牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)室温下孵育1 h。若是synapsin I 和filamentous-actin(F-actin)双染，神经细胞先结合用1% BSA 稀释的synapsin I多克隆一抗(1:100)后，在4 ℃孵育过夜；PBS漂洗后，结合Alexa 488荧光标记的二抗，暗室孵育1 h；PBS漂洗后，暗室孵育罗丹明标记的鬼笔环肽(1:25)以显示F-actin。PBS漂洗后，所有玻片倒置于加适量抗荧光淬灭封片液的载玻片上，封片。
1.4.2 神经元树突及突触分析将样品置于激光共聚焦扫描显微镜下观察，分别设置波长为 488 nm和543 nm的激光器激发绿色和红色荧光，选用63×物镜；采集红色、绿色和红绿荧光叠加的3组图片，所有图片扫描分辨率为512×512 pixel。为避免相近波长之间相互干扰，采用序列扫描模式采集图像，设置通道1为标记synapsin I 的绿色荧光，通道2为标记F-actin的红色荧光。F-actin是突触部位主要的骨架蛋白，F-actin染色可敏感标记树突形态，其与突触前synapsin I免疫荧光共标记显示突触位置。体外培养7 d前的神经细胞树突干上主要生长树突丝，然后逐渐形成树突棘。树突丝长度大于2 μm，具有指状尖端；树突棘长度为0.5~2 μm，直径约为0.5 μm，或具有球状顶端突起。测量树突丝/棘密度时，随机选取神经细胞3~5支二级树突，计数20 μm树突上的树突丝或树突棘数目，以平均值作为该细胞的树突丝/棘密度；测量突触密度时，每个神经细胞随机选取3~5支二级树突，分析20 μm树突上红、绿色荧光叠加区域的个数，以平均值作为该细胞的突触密度。参考相关文献共测算来自3个独立皿的35个细胞[9]。所有图像使用 Meta Morph 软件进行分析。
1.4.3 神经元突触蛋白表达检测采用Western blot法，DEHP处理后神经细胞用4 ℃ PBS迅速漂洗，加入细胞裂解液(1% NP-40，50 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine] ethanesulfonic acid,HEPES)，pH 7.4，2 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L 苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)，4 ℃ 12 000 g离心30 min，样品(20 μg)用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，同时用预染Marker标记目标蛋白位置，将蛋白转至硝酸纤维素膜上，再用TBS-Tween 20配制的5%脱脂奶粉于37 ℃封闭2 h，一抗β-actin(1:800)、ERK1/2、p-ERK1/2(1:800)、synapsin I(1:2 000)、PSD-95(1:1 000)、N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA)受体亚基NR2B(1:700)于37 ℃孵育2 h，TBS-Tween 20漂洗10 min×3次；37 ℃孵育辣根过氧化物酶连接的二抗1.5 h，TBS-Tween 20洗膜，化学发光免疫标记目标蛋白；β-actin作为内参，用Quantity One分析软件定量分析目的蛋白条带的光密度值。
1.5 统计分析数据用x±s表示，采用SPSS 18.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果 2.1 DEHP对海马神经元树突和突触形态发育影响(表 1)与对照组比较，0.10、1.00、10.00 μmol/L DEHP组神经元树突丝密度树突棘密度明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)；与对照组比较，0.10、1.00、10.00 μmol/L DEHP组神经元突触密度明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。
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表 1 DEHP对海马神经元树突丝/棘和突触密度影响(x±s，n=35) |
2.2 ERs介导DEHP对神经元树突和突触发育影响(表 2)
结果显示，与1 μmol/L DEHP组比较，ICI组神经元树突丝、树突棘和突触密度明显升高(P<0.01)；与17β-E2组(0.01 μmol/L)比较，1 μmol/L DEHP+0.01 μmol/L 17β-E2组神经元树突丝、树突棘及突触密度明显下降(P<0.01)。提示，DEHP具有拮抗雌激素对树突和突触形态发育的促进作用，而estrogen receptor(ER)可能介导DEHP对树突和突触发育的抑制作用。
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表 2 ERs介导DEHP对神经元树突和突触密度影响(x±s，n=35) |
2.3 DEHP对海马神经元突触蛋白和p-ERKs表达水平影响(图 1、表 3)
结果显示，与对照组比较，0.10、1.00 μmol/L DEHP组神经元synapsin I、post synaptic density protein 95(PSD-95)和 N-methyl-D-aspartate receptor 2B subunit(NR2B)表达水平均下降(P<0.01)；与对照组比较，DEHP组神经元ERK1/2蛋白表达水平无明显变化，DEHP组神经元p-ERK表达水平明显下调(P<0.01)。提示DEHP 抑制海马树突和突触发育可能与其下调神经元ERKs信号通路表达有关。
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注：1：对照组；2、3：0.10、1.00 μmol/L DEHP组。 图 1 DEHP对海马神经元突触蛋白和p-ERKs表达水平影响 |
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表 3 DEHP对海马神经元突触蛋白和p-ERKs表达水平影响(x±s=6) |
3 讨 论
海马脑区与学习记忆密切相关，是性激素调节突触可塑性的重要靶位。最近发现，在大鼠出生后16~22 d暴露于环境内分泌干扰物(DEHP)显著降低雄鼠海马CA3区轴突标志物以及齿状回和CA3区成熟和未成熟神经元密度[10]。本研究结果显示，DEHP暴露5 d，海马神经元树突丝、树突棘和突触密度明显下降，该作用可被雌激素受体阻断剂ICI182,780部分消除；同时DEHP可拮抗E2对树突丝、树突棘和突触密度的促进作用。提示，DEHP暴露可抑制海马神经元树突和突触形态发育。
树突丝和树突棘是树突干上主要突起，在神经元发育早期，树突丝通过快速伸缩运动，参与树突棘和突触形成；随后，树突丝密度下降，而树突棘和突触密度增加。精确突触连接是神经元之间网络功能发育的关键，而形态学上的变化可改变突触间传递效能[11]。树突形态和突触可塑性对雌激素敏感，可随大鼠动情周期血清雌激素水平波动而变化[11]。本研究结果显示，17β-E2可显著增加海马神经元树突丝/棘和突触密度；与17β-E2组比较，DEHP+17β-E2组神经元树突丝/棘和突触密度明显下降，提示DEHP具有拮抗雌激素作用。DEHP是一类具有弱雌激素和抗雄激素活性的内分泌干扰物，DEHP 可降低大鼠血清雌激素水平并抑制排卵[12]。体外研究显示，DEHP及其主要代谢产物邻苯二甲酸单-2-乙基己酯[mono(2-ethylhexyl)phthalate,MEHP]与E2共同处理均可抑制体外窦状卵泡生长并降低其雌激素水平[13]。这可能与DEHP抑制雌激素的合成有关，MEHP可干扰编码芳香化酶的基因转录而影响雄激素转化成雌激素的关键酶——芳香化酶的合成而影响体内雌激素的正常水平[14]。本研究结果表明，DEHP暴露前先用ER阻断剂ICI 182,780预处理，可部分消除DEHP对树突和突触形态发育的抑制作用，提示ER可能参与DEHP对海马神经元形态发育影响过程。
Synapsin I是突触前蛋白，主要调节突触囊泡移动并聚集到活性带区域而调控神经递质的释放，同时也参与突触形成[15]。Synapsin I基因缺失的小鼠突触前活性带囊泡密度降低[16]。PSD-95是突触后的脚手架蛋白，能锚定受体和下游信号分子于突触后致密区，为突触受体活动和稳定性所必需[17]。PSD-95基因敲除小鼠树突棘形态变化和棘稳定性均减弱，长时程增强(long-term potentiation，LTP)诱导受阻，而过表达PSD-95的小鼠树突棘密度增加，微小兴奋性突触后电流增大[18]。NMDA受体在突触传递和可塑性中发挥重要作用，其中突触上的NMDA受体含NR2B亚基[19]。研究显示，含NR2B的NMDA受体介导海马的LTP[20]。前脑过表达NR2B的转基因小鼠突触可塑性增强，动物学习能力升高[19]。本研究结果显示，DEHP可明显下调synapsin I、PSD-95、和NMDA受体NR2B亚基表达水平。提示DEHP暴露下调突触蛋白synapsin I、PSD-95和NMDA受体NR2B表达可能与其抑制树突和突触发育有关。
胞外调节蛋白激酶(ERKs)是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成员之一，参与调节突触可塑性和学习记忆[21]。阻断ERKs信号通路可抑制海马长时程抑制(long-term depression,LTD)的诱导[22]。研究显示，ERK1/2参与脑内雌激素和环境雌激素对中枢神经系统的作用[23]。神经末梢的synapsin I是ERKs的主要底物，轴突末梢的ERK激活可磷酸化synapsin I而调控突触囊泡的分配和回收[15]。NMDA诱发皮质神经元ERKs磷酸化主要由含NR2B的NMDA受体介导[24]。本研究结果显示，DEHP暴露对海马神经元ERK1/2表达无明显影响，但明显降低ERK1/2磷酸化水平。表明DEHP可能通过抑制ERKs信号通路激活，降低突触蛋白表达水平，从而抑制海马神经元树突和突触形态发育。
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