2016, Vol. 32
2. 复旦大学公共卫生学院教育部公共卫生重点实验室, 上海 200032;
3. 复旦大学卫生部卫生技术评估重点实验室, 上海 200032;
4. 安徽省安庆市立医院检验科;
5. 安徽省安庆市立医院妇产科;
6. 复旦大学公共卫生学院卫生统计学教研室, 上海 200032
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是威胁人类健康的重要问题。HBV感染的常规判定为HBsAg(HBV surface antigen)检测阳性，即显性感染。然而，已有研究证实，HBsAg检测阴性的个体中也存在HBV感染[1]，或称隐匿性乙肝感染(occult HBV infection,OBI)。其基本特征为血清HBsAg阴性但肝细胞内HBV DNA阳性，通常血清中HBV DNA滴度≤200 IU/mL[2]。母婴传播是显性及OBI感染的主要途径[3-5]。现有OBI研究多数针对献血员等人群，孕妇人群研究较少。本研究于2014年6月1日—31日以安徽省安庆市立医院为研究现场，收集156名孕妇人口学特征，并进行HBV血清学和病毒学检测，初步了解比较孕妇人群中显性HBV和OBI感染情况。
1 对象与方法 1.1 对象以2014年6月1日—31日安徽省安庆市立医院产科收治的初次住院孕妇为研究对象。纳入标准为入院时胎儿处于存活状态的孕妇。排除标准：(1)入院时胎儿已死亡；(2)入院时胎儿已分娩；(3)诊断为难免流产的孕妇；(4)拒绝参加研究的孕妇。
1.2 数据和标本收集通过入院孕妇的临床记录和本研究自拟的调查问卷，收集孕妇人口学等资料。同时，在知情同意下(复旦大学伦理委员会批件，批件号：IRB#2013-03-0435)，于孕妇入院后第2 d，床边抽取外周静脉血5 mL：室温静置约1 h后，以4 000 r/min 离心15 min，吸取足量上清液置于灭菌Eppendorf 管，双管分装(A管用于血清生化、免疫学等指标及HBV DNA定量检测，B管仅用于血清HBV 基因扩增)。所有分离血清置于-80 ℃保存备检。
1.3 方法 1.3.1 血清生化和免疫学检测使用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)[英科新创(厦门)科技有限公司]和电化学发光法[罗氏诊断产品(上海)有限公司]对所有孕妇血清进行HBsAg平行检测。同时，对孕妇血清检测其他乙肝血清学指标(HBsAg、HBeAg、HBeAb、HBcAb)[英科新创(厦门)科技有限公司]。此外，使用罗氏P800全自动生化仪及原装配套试剂，通过速率法检测血清中ALT和AST。
1.3.2 血清HBV DNA定量检测采用实时荧光定量PCR法(乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒,上海科华生物工程股份有限公司)对血清中HBV DNA进行定量分析。试剂盒检测范围为500~108 IU/mL。
1.3.3 HBV S、前S及前C\C基因扩增取 200 μL血清，严格按照试剂说明书进行DNA提取(DNA提取试剂盒，德国QIAGEN公司)。抽提的DNA立即用于后续实验或储存于-20 ℃备用。采用巢式PCR扩增，目的片段为HBV S基因、前S基因及前C/C基因序列。S基因第1轮扩增引物为S1(5′-CCTGCTGGTGGCTCCAGTTC-3′，nt 56~75)和S2(5′-ATACCCAAAGACAAAAGAAAA-3′，nt 827~807)；第2轮扩增引物为S3(5′-GCGGGGTT TTTCTTGTTGAC-3′，nt 203~222)和S4(5′-GGGACTCAAGATGTTGTACAG-3′，nt767~787)。前C/C基因第1轮扩增引物为C1(5′-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCGTATAA-3′，nt 1763~1792)及C2(5′-CTGACTACTAATTCCCTGGATGCTGGGTCT-3′，nt2032~2061)；第2轮引物为C3(5′-GACGAATTCCATTGACCCGTATAAAGAATT-3′，nt 1778~1807)及C4(5′-ATGGGATCCCTGGATGCTGGGTCTTCCAAA-3′，nt 2017~2046)。S、前C/C基因PCR扩增条件为94 ℃变性35 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，第1轮及第2轮PCR扩增分别为35和25个循环[4]。前S区扩增引物第1轮为PS1(5′-GGGTCACCATATTCTTGGG-3′，nt 2814~2832)及PS2(5′-CAAAGACAAAAGAAAATTGG-3′，nt 803~827)，第2轮引物为PS3(5′-GAACAA-GAGCTACAGCATGGG-3′，nt 2832~2852)及PS2(5′-GGTAAAAAGGGACTCAAGATG-3′，nt 775~795)。前S区扩增条件为95 ℃变性35 s、58 ℃退火35 s、72 ℃延伸120 s，2轮PCR扩增均为30个循环[6]。上述引物均由上海华大基因工程公司合成，引物位置参考株Gen Bank登陆号为AB076679。所有实验均设置阳性对照、阴性对照和空白对照。PCR产物经琼脂凝胶电泳，若样品在相应位置有亮条带，则认定该样品在相应基因片段的PCR结果呈阳性，阳性结果样本由不同人员于不同实验室进行重复实验，以避免污染，2次结果一致者确定为阳性。
1.3.4 HBV感染判定标准及测序经ELISA和电化学发光法中任一方法检测HBsAg阳性，即判定其为显性HBV感染。上述2种方法检测HBsAg阴性，同时S基因、前S基因及前C/C基因3个片段中有2个出现阳性者，即判定为OBI[6]。所有判定为显性HBV感染及OBI的S基因片段PCR扩增产物，由上海华大基因生物工程公司进行测序。
1.3.5 基因型及突变分析应用软件MEGA6.06，对测得的HBV S基因核苷酸序列(目的区域为nt 223~nt766，共544 bp，参考株AB076679)进行分析。HBV参考株为：A基因型：AY373432，DQ315784；B基因型：AY206390，AY206391，AY800391和X97850；C基因型：AB033557和AB112063；D基因型：EU939680，X65259；E基因型：AB032431，AB091256；F基因型：AB036905，AB116654；G基因型：AB056515，AB064 313；H基因型：AB059661，AB375161；I基因型：AF241408，AF241409。使用邻接法构建进化树，计算进化参数及位点替换率，并根据S基因核苷酸序列推导的第122位、127位、134位、159位、160位、177位及178位氨基酸判定HBV株血清型[7]。
1.4 统计分析数据分析使用SPSS 18.0软件。描述性统计以均值或比例报告，均值和比例的比较分别使用t检验或方差分析、Pearson χ2检验或Fisher精确概率法以及Poisson检验等。检验水准α均设为0.05。
2 结 果 2.1 一般情况本研究共纳入住院孕妇156人，平均年龄为(28.1±4.6)岁，23~29岁占65.4%(102/156)；平均孕周为(35.5±6.2)周，36~40周占51.9%(81/156)。研究对象以无业(37.2%，58/156)及自由职业(15.4%，24/156)为主，主要来自安庆市区及其所辖县(80.8%，126/156)。妊娠结局以活产分娩为主，占79.5%(124/156)，保胎及流产各占17.3%(27/156)及3.2%(5/156)。
2.2 孕妇HBV感染及人口学分布特征(表 1、2)156名孕妇中，HBV显性感染和OBI感染率分别为10.3%(16/156)和8.6%(12/140)。未发现显性感染组、OBI组和非HBV感染组孕妇在年龄、职业、孕周及妊娠结局等人口学特征上有明显差异。此外，将显性感染组与OBI组进行比较，2组在上述人口学特征上的差异并无统计学意义。HBV感染组中，6例孕妇血清HBV DNA定量阳性(显性感染5例，OBI感染1例)，其HBV DNA中位数为5.7×106 IU/mL(四分位数范围：1.3×105 IU/mL ~5.9×107 IU/mL)；OBI感染1例，滴度为6.0×103 IU/mL。对156名孕妇进行乙肝疫苗接种史调查，结果显示，有接种史、未接种及不详的比例分别为21.2%、10.2%及68.6%。乙肝疫苗接种史在显性感染组、OBI组及非HBV感染组3组间差异无统计学意义。
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表 1 显性HBV感染、OBI感染及非HBV感染人口学分布特征 |
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表 2 12例OBI孕妇人口学、血清学及病毒学特征 |
2.3 HBV S基因进化分析 2.3.1 基因型和血清型(图 1)
本研究共获得HBV病毒S基因序列13株(7株显性HBV，6株OBI)。使用核苷酸差异数距离模型将13例HBV株进行两两比对，未发现完全一致的核苷酸序列。所有病毒株均为B基因型，进化树见图 1。除了1例OBI株为ayw1血清型外，其余12例均为adw2血清型。
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图 1 HBV S基因系统进化树 |
2.3.2 核苷酸分析
13株HBV的总体核苷酸位点替换率为6.5‰(46/7 072)，显性株和OBI株核苷酸位点替换率分别为5.5‰和7.7‰，无统计学差异(P>0.05，Poisson检验)。共33个位点发生核苷酸替换，其中，显性株和OBI株均出现的替换有7个位点，仅OBI株、或仅显性株出现的替换分别为15个和11个位点。特别的是，显性HBV株出现A499G/C替换，OBI病毒株出现了1例插入突变，在第751位与第752位核苷酸间插入核苷酸(G)。但由于例数较少，以上替换在显性株与OBI病毒株间差异无统计学意义。
2.3.3 氨基酸分析13株HBV总体氨基酸位点替换率为1.1%(25/2 353)，显性株和OBI株氨基酸位点替换率分别为7.1‰(9/1 267)和14.7‰(16/1 086)，差异无统计学意义(P>0.05，Poisson检验)。由于核苷酸替换，使得氨基酸出现了同义(39.4%，13/33)或非同义替换(60.6%，20/33)。HBV S区共有181个氨基酸，其中aa99~aa169为主要亲水区(major hydrophilic region，MHR)。无论是MHR还是非MHR区域，OBI病毒株氨基酸替换次数均大于显性HBV感染株，但差异并无统计学意义。MHR区域中，3个位点替换(S114A、K122R、C137W)仅发生在OBI病毒株，而W165R则仅出现于显性病毒株；非MHR区域中，C76Y和F80S仅发生在显性株，5个位点替换(S61L、P67Q、W201L、P203A和S204K/N)仅发生在OBI病毒株。需要特别指出的是，由于1株OBI株出现了插入突变，该病毒株氨基酸在位点200、201、203、204处发生错义突变(F200V，W201L，P203A，S204K)，在202位点出现同义突变(G202G)。此外，显性株发生F200Y替换，未发生插入突变的OBI病毒株中出现了S204N替换。由于例数较少，上述氨基酸变异在显性及OBI病毒株间的差异无统计学意义。
3 讨 论本研究发现孕妇人群携带有较高比例的HBV，显性与隐匿性HBV感染大致相当； HBV病毒株均为基因B型，仅1例OBI病毒株为ayw1血清型，其余12株均为adw2血清型。在HBV高感染流行区，携带HBV的育龄女性是围产期传播的一个重要传染源。本次调查发现安徽省安庆市孕妇人群HBsAg阳性率为10.3%，高于中国及安徽省一般人群的表面抗原携带率[8]，也高于国内其他研究孕妇人群表面抗原携带率[9]。这可能与本次研究使用灵敏度较高的化学发光法有关，同时也提示这部分地区孕妇人群显性HBV感染率仍较高。OBI感染分布特征与显性HBV感染率、地区及人群特征有关，并受到标本类型、HBsAg及HBV DNA检测灵敏度的影响。对于孕妇或育龄妇女，韩国、加纳、突尼斯、中国研究报告OBI感染比例分别为11.39%、1.1%、4%和5.7%[10-12]。之前对39岁育龄妇女研究发现有10.2%(6/59)的OBI感染率[4]。本次调查发现安庆市孕妇人群中OBI的感染率为8.6%，与显性HBV感染比例相当，提示孕妇人群中存在不低比例的OBI，其母婴传播群体影响不可忽视。Walz等[13]研究认为OBI存在明显的产前传播，康汉珍等[14]研究发现OBI孕妇分娩的新生儿OBI感染率为14%。根据中国现有的乙肝免疫策略，OBI母亲将被视为非HBV感染，其小孩将采取与健康母亲所生小孩相同等的乙肝免疫策略，但OBI母亲又具有与显性HBV感染相似的阳性HBV DNA。因此，现有乙肝疫苗对OBI母亲引起的婴儿感染阻断效果评估以及阻断OBI母婴传播的有效免疫策略值得进一步探讨。病毒载量是影响母婴传播的一个重要因素。即使注射了乙肝免疫球蛋白(hepatitis B immune globulin,HBIG)并接种了疫苗，较高的HBV病毒载量仍可能增加新生儿感染慢性HBV的风险[15]。
本次研究中，显性HBV感染孕妇血清HBV DNA水平均较高，母婴传播风险不容忽视。而在OBI感染组中，仅发现1例血清定量HBV DNA阳性，且水平较低，但这例孕妇有过乙肝感染史，其可能是处于丢失HBsAg状态的慢性乙肝感染者。可以看到，OBI感染组血清病毒载量较显性感染低，但是由于样本量的限制，这样的差异无统计学意义。目前已有研究发现抗病毒治疗可以有效预防高病毒载量孕妇显性HBV围生期传播[16-17]。但是低病毒载量的OBI孕妇发生母婴传播的风险以及预防OBI母婴传播有待进一步研究。以往的一些研究认为，与显性HBV病毒株相比，C基因型在OBI病毒株出现的比例更高，可能为其优势基因型[4, 18-19]；但本次研究发现的HBV病毒株均为B基因型，是否与孕妇特殊的生理与免疫状态有关，值得进一步研究。另外，病毒血清型，与热点变异的频率也有一定程度的相关性。adw型的氨基酸变异聚集于“α”决定簇和CTL表位，而adr血清型的变异分散[20]。本次研究仅发现1例OBI株为ayw1血清型，出现S61L及C137W变异；其余病毒株均为adw2血清型，未出现上述变异。由于ayw1型病毒株过少，两者间的差异需要进一步验证。OBI发生的分子机制尚不清楚，通常认为多种机制共同发挥作用，包括HBV基因突变、宿主对HBV的免疫应答以及其他病毒的干扰等[21]。OBI的突出特征表现为无法被基于“a”抗原决定簇而建立的现有HBsAg检测技术所识别，其本质上可归于多种原因引起的HBsAg缺乏或量上的不足、以及HBsAg发生质的变化而导致其与抗体的亲和力下降或消失[21-22]。“α”抗原决定簇位于HBsAg主要亲水区域(MHR)内，在HBsAg的第124和147位氨基酸间。目前OBI病毒株中报道较多的“α”决定簇的变异形式有G145R、P120T、I/T126N/A，F161Y等[23]。而OBI的发生不仅仅限于“α”决定簇的突变所致，病毒蛋白的变异比调节蛋白更为重要[24]；OBI出现低水平HBV DNA水平，可能与HBV复制周期中转录、蛋白质合成、病毒分泌、组装等障碍有关[25]。本次研究发现仅显性HBV株出现A499G/C，可能成为临床诊断显性和隐匿性感染的依据。另外，HBV病毒株多数替换发生在非MHR区域，如N40S、G44E替换等。与显性感染株相比，无论是MHR或非MHR区域，OBI病毒株均出现较多的氨基酸替换。非MHR区域核苷酸替换的生物学功能有待更深入的研究。此外，发现S114A，K122R，C137W(MHR区)以及S61L，P67Q，W201L，P203A的氨基酸替换(非MHR区)仅发生在OBI病毒株中，且显性病毒株发生F200Y替换，而OBI发生F200V替换；在位点204处，OBI株发生S204K及S204N替换，显性病毒株并未发生替换。但是由于样本例数较少，上述显性HBV和OBI病毒株的差异并无统计学意义。另外，由于在OBI病毒株中发现1例插入突变，一些位点的变异是由于插入突变导致或是其病毒株特有的变异有待进一步探讨。中国是HBV感染高发区，母婴传播是显性乙肝感染的重要途径，目前也已证实OBI存在母子(女)传播[5]。因此，了解孕妇人群中HBV显性和隐匿性的感染特点，对于更好地预防和控制HBV有积极作用。本研究结果表明，安徽省安庆市孕妇人群中显性和隐匿性乙肝感染率均较高，显性与隐匿性病毒株分子生物学特点有待进一步研究。
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