肠道病毒71型(entervirus 71，EV71 )是引起手足口病(hand-foot-and-mouth disease, HFMD)的主要病原体之一。EV71感染的患儿临床表现并不完全一致^[1]，轻者仅表现为发热和疱疹等；重者可引起神经系统并发症。EV71基因组是单股正链RNA，含1个开放阅读框(open reading frame，ORF)^[2]，编码4个结构蛋白(VP1-VP4) 和7个非结构蛋白(2A-2C和3A-3D)，3C与3D蛋白对病毒的复制至关重要。本研究利用反向遗传技术重组EV71强毒株(SDLY107) 与弱毒株(SDLY1) ，将SDLY1株的3C和3CD蛋白编码区与SDLY107株置换，在横纹肌肉瘤细胞中拯救获得重组病毒107(1-3C)和107(1-3CD)，为研究3C与3D蛋白在EV71致病机制中的作用奠定基础。

人横纹肌肉瘤细胞(rhabdomyosarcoma cell，RD)(山东省疾病控制中心陶泽新医师惠赠)。病毒SDLY107和SDLY1株分离自临沂市人民医院的患儿^[3]，SDLY107 株分离自1 例HFMD 合并脑炎的死亡患儿，SDLY1株分离自单纯HFMD患儿。pMD19-T-107全长质粒(山东大学公共卫生学院病毒学研究室保存)。RD细胞生长至对数生长期时接种病毒，待细胞病变至80%左右时，-40 ℃和室温之间反复冻融3次后4 ℃ 10 000 g离心10 min收获，储存于-80 ℃冰箱中。

病毒RNA提取试剂盒(中国OMEGA公司)、DNA胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒(中国OMEGA公司)；逆转录试剂盒(日本TOYOBO公司)；体外转录试剂盒(美国Promega公司)；高效保真酶PrimeSTAR GXL DNA Polymerase、pMD19-T(中国TaKaRa公司)；限制性内切酶、转染试剂(美国Thermo公司)；细胞培养基、血清(美国HyClone公司)；引物(上海生工生物工程股份有限公司合成)；测序(上海博尚生物技术公司完成)。PCR仪(德国Eppendorf公司)、PCR电泳仪(美国BIORAD公司)、多功能数字图像分析仪(美国ProteinSimple公司)、细胞培养箱(美国Thermo公司)和光学倒置显微镜(日本Olympus公司)。

SDLY107与SDLY1株病毒的cDNA 使用OMEGA公司的Viral RNA kit 试剂盒提取SDLY107与SDLY1株病毒的RNA，使用TOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR Kit 逆转录生成cDNA。分别在pMD19-T-107全长质粒的基础上进行重组病毒SDLY107(1-3C)和SDLY107(1-3CD)株的拯救。酶切位点ApaⅠ为SDLY107株和SDLY1株病毒共同自身含有；XbaⅠ为引入位点；HindⅢ为pMD19-T含有的位点。引物见表 1。使用引物1、2，以SDLY1株cDNA为模板，扩增3C蛋白编码区；使用引物3、4，以SDLY107株cDNA为模板，扩增3D+3′UTR编码区；使用引物1、4，以扩增获得的SDLY1株3C与SDLY107株3D+3′UTR为模板进行重叠PCR，获得重组PCR产物3C(1) -3D-3′UTR(107) 。引物1的5′UTR上游引入3个3C蛋白编码序列上游的碱基CAG；引物2和引物3的5′UTR上游含有互补片段；引物4的5′UTR上游引物XbaⅠ的酶切位点。使用引物1、5，以SDLY1株cDNA为模板，扩增3CD蛋白编码区;使用引物6、4，以SDLY107株cDNA为模板，扩增3′UTR编码区；使用引物1、4，以扩增获得的SDLY1株3CD与SDLY107株3′UTR为模板进行重叠PCR，获得重组PCR产物3CD(1) -3′UTR(107) 。引物5和引物6的5′UTR为完全互补片段。

表 1

表 1 引物序列 引物 序列 1 5′-CAGGGCCCTAGCCTTGATTTT-3′ 2 5′-CCACTGGATCTCTCCTTGTTCACTAGCAAAGTAACTCCTTTTG-3′ 3 5′-CTTTGCTAGTGAACAAGGAGAGATCCAGTGGGTTAAG-3′ 4 5′-TCTAGAT(52)GCTATTCTGGTTATAACAAATTTACCCC-3′ 5 5′-TTAACCCACTGGATCTCCCCTTGTTCAC-TAGCAAAGTAACTCC-3′ 6 5′-GGAGTTACTTTGCTAGTGAACAAGGGG-AGATCCAGTGGGTTAA-3′ 注：引物1：斜体为选取的EV71自身存在的酶切位点引物4：斜体为插入的酶切位点引物2与引物3，引物5与引物6：下划线为互补片段。

表 1 引物序列

分别将PCR产物3C(1) -3D-3′UTR(107) 和3CD(1) -3′UTR(107) T-A克隆连接入pMD19-T载体，形成pMD19-T-3C(1) -3D-3′UTR(107) 与pMD19-T-3CD(1) -3′UTR(107) 。分别使用限制性内切酶ApaⅠ和XbaⅠ对pMD19-T-3C(1) -3D-3′UTR(107) 、pMD19-T-3CD(1) -3′UTR(107) 和pMD19-T-107进行双酶切，并分别回收3C(1) -3D-3′UTR(107) 、3CD(1) -3′UTR(107) 和pMD19-T-107-(107-为去除3CD-3′UTR编码区的剩余片段)。使用T4连接酶分别连接pMD19-T-107-与3C(1) -3D-3′UTR(107) 、3CD(1) -3′UTR(107) ，得到pMD19-T-107(1-3C)与pMD19-T-107(1-3CD)。

使用XbaⅠ和HindⅢ对pMD19-T-107(1-3C)、pMD19-T-107(1-3CD)进行双酶切，使其线性化，并回收107(1-3C)、107(1-3CD)。使用RiboMAX Ⅲ Large Scale RNA Production Systems-T7试剂盒进行体外转录，RNA提取试剂盒对RNA进行提取。

分别将1 μg的107(1-3C)、107(1-3CD)全长RNA转染入刚铺满单层的RD细胞，约72 h小时后收获细胞，置-40 ℃和室温冻融3次后，接种至刚铺满单层的RD细胞，每孔200 μL。培养72 h后收获细胞并冻融3次，接种至刚铺满单层的RD细胞。全程观察细胞病变情况，并设置阴性及SDLY107、SDLY1株作为对照。

分别提取拯救病毒107(1-3C)、107(1-3CD)的RNA，逆转录生成cDNA，使用引物1、4对3CD编码区进行扩增后回收，测序鉴定。

3C(1) 、3D-3′UTR(107) 和3C(1) -3D-3′UTR(107) ；3CD(1) 、3′UTR(107) 和3CD(1) -3′UTR(107) PCR扩增产物长度分别约为550、1 500、2 100、2 000、130、2 100 bp(A~F)。

图 1

注： A：SDLY1株3C 扩增产物，maker1为DL2, 000(bp)； B：SDLY107株3D-3′UTR扩增产物，maker2为DL2, 000(bp)； C： 融合PCR产物3C(1) -3D-3′UTR，make3r为DL5, 000(bp)； D： SDLY1株3CD扩增产物，maker4为DL2, 000(bp)；E： SDLY107株3′UTR扩增产物，maker5为DL2, 000(bp)； F：融合PCR产物3CD(1) -3′UTR(107) ，maker6为DL5, 000(bp)。 图 1 PCR扩增产物

(图 2) 使用限制性内切酶ApaⅠ和XbaⅠ对pMD19-T-3C(1) -3D-3′UTR(107) 、pMD19-T-3CD(1) -3′UTR(107) 和pMD19-T-107进行双酶切，质粒分别被酶切为约8 000和2 100 bp、2 100和2 700 bp、2 100和2 700 bp的片段。箭头所指为需回收产物。

图 2

注：Maker1为DL10, 000(bp)；maker2为DL5, 000 (bp)；1号为pMD19-T-107双酶切产物(8000和2100 bp)；2号为pMD19-T-3C(1) -3D-3′UTR(107) 双酶切产物(2100和2700 bp)； 3号为pMD19-T-3CD(1) -3′UTR(107) 双酶切产物(2100和2700 bp)。 图 2 A：pMD19-T-107双酶切产物，;B：pMD19-T-3C(1) -3D-3′UTR(107) 和pMD19-T-3CD(1)-3′UTR(107) 双酶切。

使用XbaⅠ和Hind Ⅲ对pMD19-T-107(1-3C)、pMD19-T-107(1-3CD)进行双酶切，分别得到约为7 400和2 700、7 400和2 700 bp的片段，并回收7 400 bp片段。

图 3

注：Maker为DL10, 000(bp)；1号为pMD19-T-107(1-3C)双酶切产物(7400、2700bp)； 2号为pMD19-T-107(1-3CD)双酶切产物(7 400、2 700 bp)。 图 3 pMD19-T-07(1-3C)和pMD19-T-107(1-3CD)双酶切产物

将体外转录的RNA转染入RD细胞后48 h即出现明显的细胞病变，主要表现为细胞皱缩、变圆，72 h后-40 ℃反复冻融3次后收获1代病毒；将1代病毒接种至RD细胞，72 h内未出现明显的细胞病变，再次将细胞-40 ℃反复冻融3次后收获2代病毒；2代病毒接种至RD细胞，36 h后SDLY107(1-3C)与SDLY107(1-3CD)组细胞出现病变，48 h时病变可达80%。光学显微镜下观察到，重组病毒SDLY107(1-3C)、SDLY107(1-3CD)和病毒SDLY107病变没有明显区别，但3株病毒的致细胞病变能力强于SDLY1株。阴性对照组细胞没有病变。

将收获的重组病毒提取RNA后，进行逆转录为cDNA，对3CD编码区进行扩增回收后送测序公司进行测序，测序结果表明重组病毒拯救成功，分别命名为SDLY107(1-3C)和SDLY107(1-3CD)。

肠道病毒71型作为手足口病的主要病原体之一，主要感染＜5岁的婴幼儿。EV71自1969年首次分离出后，陆续在世界各地具有爆发^[4-8]。EV71感染引起的临床表现也不尽相同，轻者仅表现为发烧、疱疹等，具有自限性；而重者会引起神经系统的并发症，甚至死亡。近年来，EV71引起的HFMD在中国多地流行^{[3, 9-11]}。目前，关于EV71的致病机制尚未阐明。反向遗传技术的发展为在生物分子水平上研究EV71的致病机制提供了新的思路与途径。

研究发现，EV71 强毒株与弱毒株在ICR小鼠体内可以导致不同的病理改变；而强弱毒株在RD细胞的复制能力也存在着一定的差别，而这可能是导致EV71强弱毒株致病力不同的原因之一^[1]。3C蛋白在病毒的复制以及宿主细胞的凋亡过程中发挥重要的作用^[12]，它可以抑制宿主细胞的转录^[13]；3D蛋白是一种RNA 依赖的RNA 聚合酶，在病毒的复制过程中主要完成RNA 链的延伸，对病毒的复制具有极其重要的作用^[14]。同时对强弱毒株的序列进行比对，发现在EV71的3C和3D蛋白编码区可能存在着影响病毒毒力的位点^[15-16]。

本研究发现直接转染RNA的RD细胞虽然可以产生cytopathic effect(CPE)，但在收获一代病毒接种至RD细胞后并未产生明显的CPE。推测RD细胞在第1代产生病变可能是由于转染试剂的毒性及第1代病毒共同作用导致的。而第1代病毒接种入RD细胞产生的第2代病毒可能由于病毒滴度较低，所以并未对RD细胞产生明显的CPE。第2代病毒在接种入RD细胞36 h后即产生CPE，48h后产生明显的CPE。同时发现重组病毒产生的CPE与SDLY107较为接近。

本实验成功将弱毒株SDLY1株的3C、3CD蛋白编码区替换到强毒株SDLY107的3C、3CD蛋白编码区，成功构建了重组的EV71反向遗传系统，拯救了重组病毒SDLY107(1-3C)和SDLY107(1-3CD)，这为我们研究3C、3D蛋白在EV71致病机制中发挥的作用奠定了良好的基础。