2016, Vol. 32
2. 济南市疾病预防控制中心 ;
3. 山东大学齐鲁儿童医院
据报道，先天性心脏病(congenital heart disease，CHD)的发病率居于出生缺陷的首位，全球每1 000个新生儿中就有5~10例患有CHD[1]。在中国，CHD是最常见的出生缺陷类型及婴幼儿死亡的首要原因[2-3]。叶酸是人体在利用糖分和氨基酸时的必要物质，体内叶酸水平的异常影响核酸合成和氨基酸代谢从而造成对人体生长发育的影响[4]。亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)基因是叶酸代谢通路上最关键的基因之一，MTHFR参与尿嘧啶脱氧核苷酸到胸腺嘧啶脱氧核苷酸的转化过程，当MTHFR功能减弱时该反应的甲基化过程发生紊乱而导致CpG位点的突变，可能会造成DNA化学结构改变。此外，MTHFR催化5，10-亚甲基四氢叶酸转变为5-亚甲基四氢叶酸所产生的甲基可以使同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)生成甲硫氨酸[5]，若MTHFR基因发生突变将扰乱该过程，造成Hcy的代谢异常而在体内积聚，从而导致CHD 的发生[6-7]。为探讨5,10-MTHFR基因多态性与CHD的关系，为CHD的防治提供参考依据，本研究采用以医院为基础的病例对照研究方法抽取2012年12月—2013年11月山东大学齐鲁儿童医院就诊的150例患有单纯性CHD的患儿及同期在该医院儿童保健科进行查体的150名健康儿童分别作为病例组和对照组，检测2组儿童MTHFR基因C677T、A1298C、G1793A的基因型及其分布。结果报告如下。
1 对象与方法 1.1 对象将2012年12月—2013年11月在山东大学齐鲁儿童医院就诊的150例患有单纯性CHD的患儿作为病例组；选择在该医院儿童保健科进行查体的150名健康儿童作为对照组。病例组患儿均为经过心脏彩超及手术确诊者，包括室间隔缺损、房间隔缺损、动脉导管未闭、法洛四联症、大动脉转位、永存动脉干等类型；对照组儿童均为经一般检查和问诊排除患病和其他特殊遗传体征的健康儿童。所有研究对象年龄均＜3岁。
1.2 方法 1.2.1 DNA提取与PCR扩增抽取病例组和对照组儿童空腹外周静脉血约2 mL，置于-20 ℃冰箱备用。由山东大学齐鲁儿童医院儿科医学研究所分子生物学实验室应用苯酚氯仿法提取基因组DNA，设计引物，采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增包含MTHFR C677T、A1298C、G1793A基因位点的目的片段。3个位点的扩增引物序列如下：MTHFR C677T：上游引物： 5′-GCCTCTCCTGACTGTCATCC-3′，下游引物：5′-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3′；MTHFR A1298C：上游引物：5′-GCAAGTCCCCCAAGGAGG-3′，下游引物： 5′-GGTCCCCACTTCCAGCATC-3′；MTHFR G1793A：上游引物：5′-CTCTGTGTGTGTGTGCATGTGTGCG-3′，下游引物：5′-GGGACAGGAGTGGCTCCAACGCAGG-3′。 PCR反应体系为25 μL，包括2.5 μL 10×PCR buffer、2 μL dNTP(2.5 mmol/L)、各1 μL正反向引物(10 μmol/L)、1 μL模板DNA(40 ng/μL)、 0.2 μL Taq酶，其余水补足。PCR反应程序如下：MTHFR C677T：95 ℃预变性5 min；进入循环，95 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环35次；72 ℃终延伸5 min；4 ℃冷却保存。MTHFR A1298C：95 ℃ 预变性5 min；进入循环，95 ℃变性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环35次；72 ℃ 终延伸5 min；4 ℃冷却保存。MTHFR G1793A：95 ℃预变性5 min；进入循环，95 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环35次；72 ℃终延伸5 min；4 ℃冷却保存。
1.2.2 酶切将PCR产物分别用不同的限制性内切酶水浴消化，酶切条件如下：MTHFR C677T：HinfⅠ内切酶1 μL，10×loading buffer 1 μL，PCR扩增产物8 μL,37 ℃水浴进行酶切反应3 h；MTHFR A1298C：MboⅡ内切酶1 μL，10×loading buffer 1 μL，PCR扩增产物8 μL,37 ℃水浴酶切5h；MTHFR G1793A：BsrbⅠ内切酶1μL，10×loading buffer 1 μL，PCR扩增产物8 μL,37 ℃水浴酶切3 h。MTHFR C677T、A1298C、G1793A位点酶切产物分别用2.5%、3.0%、2.0%的琼脂糖凝胶电泳分离检测，SYBR染色，用紫外凝胶成像系统检测酶切产物片段大小，分析基因型。
1.3 统计分析应SPSS 13.0统计软件进行统计分析。采用χ2检验和t检验对2组儿童性别和年龄进行均衡性检验；采用Hardy-weinberg遗传平衡方法检验对照组是否符合Hardy-weinberg遗传平衡，以确定2组儿童对于源人群所具有的代表性；采用单因素logistic回归分析模型分析2组儿童各位点等位基因、基因型频率以及多个不同位点各种组合基因型的差异，并计算OR值以及95%CI。所有统计学检验均为双侧概率检验，检验水准α=0.05。
2 结 果 2.1 一般情况病例组150例单纯性CHD患儿中，男性77例(51.3%)，女性73例(48.7%)，平均年龄为(1.3±1.2)岁；对照组150名健康儿童中，男性71例(47.3%)，女性79例(52.7%)，平均年龄为(2.0±1.7)岁；2组儿童性别、年龄比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。150例单纯性CHD患儿中，室间隔缺损79例(52.7%)，房间隔缺损29例(19.3%)、动脉导管未闭17例(11.3%)，法洛四联症9例(6.0%)，大动脉转位6例(4.0%)，永存动脉干10例(6.7%)，均不合并其他先天畸形。
2.2 Hardy-Weinberg遗传平衡检验(表 1)采用Hardy-Weinberg遗传平衡方法对3个位点的基因型分布进行平衡检验，结果显示，对照组符合Hardy-Weinberg遗传平衡，样本代表性较好。
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表 1 MTHFR基因Hardy-Weinberg遗传平衡检验 |
2.3 MTHFR基因3个位点多态性与CHD患病关系(表 2)
MTHFR C677T位点T等位基因儿童患CHD的风险为C等位基因的1.813倍(信χ2=12.990，P=0.000)，CT、TT、CT+TT基因儿童患CHD的风险分别为CC基因的2.249、3.121、2.489倍(均P<0.01)；MTHFR A1298C位点C等位基因儿童患CHD的风险为A等位基因的2.017倍(χ2=5.785，P=0.016)，AC基因儿童患CHD的风险为AA基因的2.177倍(χ2=6.434，P=0.011)；MTHFR G1793A位点G与A等位基因和 GG与GA基因儿童患CHD的风险差异均无统计学意义(均P>0.05)。
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表 2 MTHFR基因3个位点等位基因及基因型分布 |
2.4 MTHFR基因3个位点组合基因与CHD患病关系 2.4.1 MTHFRC677T与A1298C组合基因与CHD患病关系(表 3)
结果显示，MTHFR C677T与A1298C位点CC/AC、CT/AA、CT/AC、TT/AA、TT/AC组合基因儿童患CHD的风险分别为CC/AA组合基因的3.039、2.718、3.545、2.861、7.091倍(均P<0.05)。
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表 3 MTHFR C677T与A1298组合基因型分布 |
2.4.2 MTHFRC677T与G1793A组合基因与CHD患病关系(表 4)
结果显示，MTHFR C677T与G1793A位点TT/GG组合基因儿童患CHD的风险为CC/GG组合基因的2.551倍(χ2=7.133，P<0.05)，CC/GA、CT/GG组合基因与CC/GG组合基因儿童患CHD风险比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。
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表 4 MTHFR C677T与G1793A组合基因型分布 |
2.4.3 MTHFRA1298C与G1793A组合基因与CHD患病关系(表 5)
结果显示，MTHFR A1298C与G1793A位点AC/GG组合基因儿童患CHD的风险为AA/GG组合基因的2.505倍(χ2=6.448，P=0.011)，AA/GA、AC/GA组合基因与AA/GG组合基因儿童患CHD风险比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。
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表 5 MTHFR A1298C与G1793A位点组合基因型分布 |
3 讨 论
目前国内外已有较多关于MTHFR C677T与CHD关系的研究，认为该突变与CHD有关。2005年，Lee 等[8]发现MTHFR C677T位点TT基因个体在室间隔正常的肺动脉闭锁以及肺动脉瓣狭窄的患者中比例明显高于正常对照组，提示突变可能与该先天心脏畸形的形成有关。Zhu等[9]发现，携带突变T等位基因增加了房间隔缺损和动脉导管未闭的易感性。此外，Zhu等[10]最新研究分析了若干 单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，提示MTHFR C677T位点的T等位基因是CHD患病的危险因素。本研究结果与上述研究观点相符。与MTHFR C677T位点CC基因比较，携带CT基因儿童患CHD的风险为携带CC基因儿童的2.249倍(OR=2.249，95%CI=1.305~3.877)，而携带TT基因儿童患CHD的风险为携带CC基因儿童的3.121倍(OR=3.121，95%CI=1.612~6.043)，纯合突变对于CHD的致病力大于杂合突变，有剂量效应关系。
对于MTHFR A1298C位点与CHD的关联，有报道认为杂合突变AC提高了患先心病的危险，但也有研究未发现两者之间的关联，甚至认为发生突变是CHD患病的保护因素[10-13]。本研究结果支持前者，MTHFR A1298C位点C等位基因儿童患CHD的风险为A等位基因的2.017倍(OR=2.017，95%CI=1.128~3.604)，AC基因儿童患CHD的风险为AA基因的2.177倍(OR=2.177，95%CI=1.183~4.077)。
关于MTHFR G1793A与CHD的研究国内外较少，缺乏有效的数据。有研究认为该位点GA、AA基因能降低患CHD的危险性，是一种保护因素(OR=0.67，95%CI=0.54~0.84，P=0.000 4)，且对于膜周部和心室间隔发生的保护作用尤其明显(OR=0.6，95%CI=0.43~0.83，P=0.000 3)[14]。而本研究未发现该位点的多态性对CHD的独立作用。
上述变异导致的CHD患病风险增高可能与突变导致DNA低甲基化有关，突变通过影响MTHFR酶活性影响了甲基供体S-腺苷甲硫氨酸的合成，造成甲基供应不足和DNA的低甲基化[4]。此外，MTHFR活性降低还引起Hcy生成甲硫氨酸过程异常而造成Hcy代谢异常在体内积聚，成为致畸因子。而MTHFR G1793A位点未发现突变的作用，可能因为该位点的致病作用比较微弱，次于前两者，这符合多基因遗传的特点。
对3个位点的组合分析得到了更为丰富的信息。不同位点的不同基因组合中，2个位点同时突变的概率很低，如若发生则会对酶的活性造成严重影响并最终大幅升高血浆Hcy[12]，使得致病力明显提高。本研究结果显示，MTHFR C677T与A1298C位点、MTHFR C677T与G1793A均存在联合作用，组合基因患CHD的风险均大于单独作用。另外，虽然在单独分析时G1793A位点未见其致病作用，但与A1298C位点的组合分析可见，MTHFR A1298C与G1793A位点AC/GG组合基因儿童患CHD的风险为AA/GG组合基因的2.505倍(OR=2.505，95%CI=1.213~5.170)，表明2个位点对CHD有联合作用，也提示G1793A位点GG基因对于CHD患病的影响较为轻微。
由于突变率低和样本量等的局限，MTHFR A1298C和G1793A位点未发现CC和AA基因，在一定程度上限制了病因的探讨，此外，本研究未对孕期营养等环境因素进行有效控制，在研究结果上可能存在一定局限，因此在今后的研究中尚有待于进一步扩大样本量进行更全面的研究。
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