近年来中国结肠癌的病死率呈现明显上升的趋势，已经成为中国最常见的恶性肿瘤之一。目前认为抑癌基因和癌基因的活性失衡，是结肠癌发生的重要机制之一。Lrig1(leucine-rich repeats and immunoglobulin like domain protein 1)是新近发现的人类基因成员，定位在染色体3p14.3位点，此位点容易出现数个抑癌基因杂合性缺失。有研究报道，在前列腺癌、恶性胶质瘤、肺癌等组织中可检测到Lrig1的表达降低甚至缺失^[1-3]，但对于Lrig1在结肠癌中作用的研究较少，尚无定论。本研究运用免疫组化、逆转录PCR(reverse transcriptase-PCR，RT-PCR)和蛋白印迹(Western blot，WB)方法 检测Lrig1在结肠癌组织和细胞株与癌旁正常结肠组织和正常结肠上皮细胞中的表达，并比较其差异性，旨在探讨Lrig1在结肠癌发生发展中可能的作用，为结肠癌的诊断和基因治疗提供一个新的思路。

70例人结肠腺癌组织和36例癌旁正常组织样本(距癌缘>5 cm)均取自辽宁医学院第一临床学院病理科。选取2008年3月—2012年10月病例，所有样本均经过手术切除，并且术前均未经过放疗和化疗等其他抗肿瘤治疗。70例人结肠腺癌组织中男性38例，女性32例，年龄范围36～79岁，平均年龄64.5岁；淋巴转移29例，无转移41例；所有病例均无远处转移。Ⅰ+Ⅱ期患者18例，Ⅲ+Ⅳ期患者52例。高分化9例，中、低分化61例。

人结肠癌细胞株HCT116和人正常肠上皮细胞NCM460均购自上海中国科学院细胞库。结肠癌细胞株SW480由辽宁医学院科学实验中心提供。

SP试剂盒(中杉金桥生物技术有限公司)；胎牛血清(美国Hyclone公司)；DMEM 和RPMI 1640 培养基(美国Invitrogen公司)；胰蛋白酶(武汉博士德公司)；Trizol试剂(美国Invitrogen 公司)；兔抗人Lrig1单克隆抗体(美国Abcam公司)；PCR试剂盒(大连宝生物公司)。

采用SP法检测结肠癌组织和癌旁正常组织中Lrig1的表达，实验步骤严格按照试剂盒说明书进行。组织切片进行高压抗原修复，时间为1.5 min。

在含有100 mL/LFBS的Dulbeccos modified Eagle medium (DMEM)培养液，37 ℃，50 mL/L CO₂，饱和湿度培养下对NCM460、SW480进行孵育培养，每天观察细胞生长情况，2 d换液1次，3～4 d传代。在含有100 mL/LFBS的DMEM培养液，37 ℃，50 mL/L CO₂，饱和湿度培养下对HCT116进行进行孵育培养，每天观察细胞生长情况，2 d换液1次，3～4 d传代。

Lrig1(311 bp)上游引物5′-GAACCTTGGAGGGAATGCGA-3′,下游引物5′-TAAACCGGATGTCCTTGCCC-3′，β-actin(541bp)上游引物5′-GGGACCTGACTGACTACCTC-3′,下游引物5′-TCATACTCCTGCTTGCTGAT-3′。分别提取总RNA，以β-actin作为内参。提取的总RNA对其进行纯度及完整性判定。RT-PCR热循环参数：反应体系为50 μL，预变性95 ℃，5 min，1个循环；94 ℃变性15 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃总延伸1 min。最后4 ℃保存。每个实验重复操作3次。

收集细胞，加细胞裂解液RIPA提取细胞总蛋白，用BCA法测定蛋白的浓度。十二烷基磺酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳(sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分离蛋白后，将蛋白转移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，Tris缓冲液(Tris-buffered saline，TBS)封闭1 h，加一抗4 ℃孵育过夜，用Tris吐温缓冲液(Tris-buffered saline with Tween，TBST)漂洗3次，每次10 min；加二抗室温孵育2 h，用TBST漂洗3次，每次10 min；用电化学发光(electrochemiluminescence，ECL)、显影。独立实验重复3 次。

采用SPSS 17.0统计软件对数据进行统计分析。计数资料采用χ²检验，计量资料用x±s表示，多组均数间的比较采用单因素的方差分析及q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

通过免疫组织化学染色可见，Lrig1的阳性表达于细胞质中，呈棕褐色颗粒。在癌旁正常结肠组织中阳性表达率高于结肠癌组织，差异有统计学意义(P=0.000)。

图 1

注：图A为癌旁正常组织，图B、C、D分别为高、中、低分化结肠癌组织，图E为阴性对照(SP×400倍) 图 1 Lrig1在结肠癌组织和癌旁正常组织中的免疫组化染色

表 1

表 1 Lrig1蛋白在结肠癌组织和癌旁正常组织中表达 组织 例数 Lrig1表达 χ2值 P值 阳性(+) 阴性(-) 阳性率(%) 结肠癌组织 70 22 48 31.43 28.435 0.000 癌旁正常组织 36 31 5 86.11

表 1 Lrig1蛋白在结肠癌组织和癌旁正常组织中表达

与高分化组织比较，Lrig1在中、低分化组织中的表达明显降低，差异有统计学意义(P=0.040)；Lrig1在Ⅰ+Ⅱ期的阳性表达率明显高于Ⅲ+Ⅳ期，差异有统计学意义(P=0.000)；Lrig1在淋巴结转移组织中的阳性表达率低于无淋巴结转移组织，差异有统计学意义(P=0.008)。另外，Lrig1 蛋白的表达与患者的年龄、性别、肿瘤的大小差异无统计学意义(P>0.05)。

表 2

表 2 Lrig1的表达与结肠癌影响因素关系 因素 例数 阳性(+) 阴性(-) 阳性率(%) χ2值 P值 性别 男性 38 12 26 31.58 0.001 0.976 女性 32 10 22 31.25 年龄(岁) ＜55 29 9 20 31.03 0.040 0.952 ≥55 41 13 28 31.71 分化程度 高分化 9 6 3 66.67 4.222a 0.040 中低分化 61 16 45 26.23 TNM分期 Ⅰ+Ⅱ 18 12 6 66.67 13.961 0.000 Ⅲ+Ⅳ 52 10 42 19.23 淋巴结转移 有 29 4 25 13.79 7.145 0.008 无 41 18 23 43.90 肿瘤大小(cm) ≥5 36 11 25 30.56 0.026 0.871 ＜5 34 11 23 32.35 注：a分化程度的统计分析方法采用四格表校正χ2检验。

表 2 Lrig1的表达与结肠癌影响因素关系

RT-PCR检测结果和WB检测结果。提示结肠癌细胞株SW480和HCT116中的Lrig1 mRNA相对表达量分别为(0.65±0.09)和(0.47±0.06)，组间比较差异均有统计学意义。WB的结果显示，结肠癌细胞株SW480和HCT116中的Lrig1 mRNA表达量分别为(0.71±0.06)和(0.54±0.05)，与正常结肠上皮细胞NCM460(0.95±0.12)比较，与正常结肠上皮细胞NCM460(0.98±0.16)比较，组间比较差异有统计学意义。

表 3

表 3 不同结肠癌细胞株中Lrig1 蛋白和Lrig1 mRNA相对表达量 项目 NCM460 SW480 HCT116 F值 P值 Lrig1 mRNA 0.95±0.12 0.65±0.09a 0.47±0.06ab 34.184 0.000 Lrig1 蛋白 0.98±0.16 0.71±0.06a 0.54±0.05ab 21.644 0.000 注：a P<0.01 与NCM460组比较；b P<0.05 与SW480组比较。

表 3 不同结肠癌细胞株中Lrig1 蛋白和Lrig1 mRNA相对表达量

结肠癌是病死率较高的恶性肿瘤之一，目前认为抑癌基因和癌基因的活性失衡，是结肠癌发生的一个重要机制。Lrig1定位在人染色体3p14.3位点上^[4]，其序列长度为4763 bp。此位点容易出现致癌基因杂合性缺失。Lrig1可以与EGFR特异性结合产生负反馈抑制的一种跨膜糖蛋白，并对上皮干细胞的稳定性起到维持的作用^[5-6]。所以，Lrig1的功能可能是抑制肿瘤细胞增殖。

本研究中癌旁组织中Lrig1的阳性表达明显高于结肠癌组织，说明Lrig1基因在结肠癌的发生发展中可能是一种抑癌基因。另外Lrig1在结肠癌组织中的表达与分化、分期及有无淋巴结转移有关，与性别、年龄和肿瘤大小无关，具体机制尚需进一步研究。应用RT-PCR和Western blot技术对细胞株中Lrig1 mRNA和蛋白表达进行分析，Lrig1在结肠癌细胞中呈低表达趋势，提示Lrig1基因在结肠癌的发生发展中可能起到抑癌基因的作用，与Nagata 等^[7]报道的Lrig1在皮肤鳞癌中的作用以及Thomasson等^[8]报道的其在前列腺癌中的作用相类似。与李春燕等^[9]报道的Lrig1在结肠腺癌中的表达相符，但与Ljuslinder等^[10]报道的不一致，这可能是由于选取样本的组织类型不同造成的。目前关于Lrig1蛋白的功能研究是个热点问题^[11-12]，本实验推断Lrig1在结肠癌的发生发展中可能起着抑癌基因的作用，下一步研究将就其作用机制展开。