胃癌在全世界范围内发病率及死亡率均居于前列，5年生存率不足30%，严重威胁人们的身心健康^[1-2]。研究发现导致胃癌治愈率低下，预后差的主要原因是肿瘤早期诊断手段不灵敏及肿瘤的侵袭转移；因此，寻找胃癌高效肿瘤标记物，可提高肿瘤的早期诊断及监测效果^[3]。乙醛脱氢酶1A1(aldehyde dehydrogenases 1A1，ALDH1A1)，是乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenases，ALDHs)基因超家族成员之一，能将外源性及内源性醛类氧化成相应的羧酸。研究显示ALDH1A1在脑角膜、晶状体、视网膜、肝以及胃肠道上皮细胞等组织中均有表达^[4]。ALDH1A1在多种肿瘤组织中高表达，其中包括胃癌^[5-7]。免疫组化方法证实胃癌组织中的ALDH1A1阳性表达高于癌旁组织，并与年龄、浸润程度、淋巴结转移、分化程度及肿瘤淋巴结转移(tumor,node and metastasis，TNM)分期有关^[5-6]。研究表明上调或下调胃癌细胞中ALDH1A1表达，可明显促进或抑制胃癌细胞的克隆形成及侵袭能力，但具体作用机制未知^[8-9]。胃癌的发生发展与多种信号通路相关，包括果蝇的无翅基因同源物(wingless protein，Wnt)信号通路^[10]。本研究通过沉默胃癌细胞MK-45中ALDH1A1基因，探讨ALDH1A1基因表达对胃癌细胞生物学行为影响及机制，旨在为胃癌的治疗提供依据。结果报告如下。

人胃癌细胞株MKN-45(中科院上海细胞库)；四唑盐(3-(4,5-dimethylthiazolv2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)、结晶紫(美国sigma公司)；兔抗基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinases 2，MMP2)、MMP9，β-连环蛋白(β-catenin)、Wnt1、Wnt5a、甘油醛3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)单克隆抗体(美国Epitmics公司)；Transwell 小室，trizol试剂盒(美国Corning 公司)；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔免疫球蛋白(immunoglobulin G，IgG)(H+L)(碧云天生物技术有限公司)。CO₂培养箱(美国Thermo Scientific公司)；TS100倒置显微镜(日本Nikon公司)；FACSCalibur型流式细胞仪(美国BD 公司)；迷你双垂直电泳仪、迷你转印电泳仪、ChemiDocTM XRS凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。

参考Trizol试剂盒说明书提取总RNA，检测RNA纯度；通过一步法逆转录PCR(reverse transcriptase-PCR，RT-PCR)试剂盒进行逆转录、扩增，扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。引物设计如下，ALDH1A1上游引物：5′-CTCGAGATGTCATCCTCAG-3′，下游引物：5′-GAATTCGTGAGTTCTTCTG-3′，148 bp；GAPDH上游引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC -3′，下游引物：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA -3′，314 bp。

由上海吉玛生物技术公司合成shRNA-ALDH1A1载体及空白载体，其中ALDH1A1的siRNA序列为5′-GTAGCCTTCACAGGATCAA-3′，对照序列为5′-TTCTCGGAACGTGTCACGT-3。当MK-45细胞汇合度达到50%~70%左右，利用Lipofectamine^TM2000脂质体转染试剂盒转染shRNA-ALDH1A1及对照组，6 h后换成含10%血清的 Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)培养基；37 ℃，CO₂培养箱培养48 h；应用RT-PCR及蛋白印迹(Western blot，WB)检测ALDH1A1 mRNA及蛋白表达。

采用MTT法，将处于生长对数期的MK-45细胞消化，细胞浓度调整为2×10⁴个/ mL，接种于96孔板，每孔200 μL，转染48 h后，加入20 μL终浓度为5 mg/mL的MTT，继续培养4 h后，加150 μL 二甲基亚砜，震荡10 min，采用酶标仪于570 nm处测吸光度(A)值，每组设3个平行孔。

将处于对数生长期的MK-45细胞消化，细胞浓度调整为2×10⁴个/mL，接种于6孔板，每孔1 mL，转染48 h后，将细胞消化加入Transwell上室，下室仅含有DMEM培养基，48 h后，将小室取出，用多聚甲醛固定，结晶紫染色，置于倒置荧光显微镜下观察下室细胞数量，取5个视野计数细胞并取平均值，即为细胞的迁移数目(个/视野)；每组设3个平行孔。

将 Matrigel 胶均匀平铺于Transwell 小室的微膜(8 μm)上，制成凝胶备用。按1.3.2 操作，最后于倒置显微镜下对5个视野中的细胞数目进行计数，取平均值，即为细胞的侵袭数目(个/视野)；每组设3个平行孔。

采用WB法，将MK-45细胞接种于6孔板，每孔1 mL，48 h后，收集细胞，加入细胞裂解液，裂解30 min，离心，吸取上清，获得总蛋白。采用BCA试剂盒测定蛋白浓度；蛋白变性，上样，进行十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳，湿法转膜。一抗(MMP2、MMP9、β-catenin、Wnt1、Wnt5a、GAPDH，稀释度均为1∶ 100)孵育，4 ℃过夜；浸入二抗溶液室 200]温孵育1~2 h；在凝胶成像系统中曝光；用“Quantity one”软件分析各抗体条带灰度值；每组设3个平行孔。

数据用x±s表示，采用SPSS 17.0软件进行统计分析，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

对照组(空白载体)MK-45细胞中ALDH1A1 mRNA及蛋白表达水平分别为(0.48±0.05)、(0.89±0.09)，shRNA-ALDH1A1组MK-45细胞中ALDH1A1 mRNA及蛋白表达水平分别为(0.08±0.01)、(0.09±0.01)；与对照组比较，shRNA-ALDH1A1组MK-45细胞中ALDH1A1 mRNA及蛋白表达量下降；表明shRNA-ALDH1A1载体转染成功。

图 1

注：1：对照组； 2：shRNA-ALDH1A1组。 图 1 shRNA-ALDH1A1对MK-45细胞中ALDH1A1 mRNA及蛋白表达影响

与对照组(0.73±0.07)比较，shRNA-ALDH1A1组MK-45细胞活力(0.40±0.04)明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)。

对照组MK-45细胞迁移数目与侵袭数目分别为(98.86±9.03)、(90.52±9.14)个/视野，shRNA-ALDH1A1组MK-45细胞迁移数目与侵袭数目分别为(39.78±3.24)、(42.53±4.25)个/视野；与对照组比较，shRNA-ALDH1A1组MK-45细胞迁移数目、侵袭数目均明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)。

结果显示，对照组细胞中MMP2与MMP9表达水平分别为(0.49±0.04)、(0.95±0.09)，shRNA-ALDH1A1组MK-45细胞中MMP2与MMP9表达水平分别为(0.10±0.01)、(0.10±0.01)；与对照组比较，shRNA-ALDH1A1组MK-45细胞中MMP2及MMP9表达均明显下调，差异均具有统计学意义(P<0.01)。

图 2

注：1：对照组； 2：shRNA-ALDH1A1组。 图 2 shRNA-ALDH1A1对MK-45细胞中MMPs表达影响

结果显示，对照组MK-45细胞中Wnt1、Wnt5a及β-catenin表达量分别为 (1.29±0.12)、(0.52±0.04)、(0.56±0.05)，shRNA-ALDH1A1组MK-45细胞中Wnt1、Wnt5a、及β-catenin表达量分别为(0.28±0.03)、(0.12±0.01)、(0.19±0.02)；与对照组比较，shRNA-ALDH1A1组MK-45细胞中Wnt1、Wnt5a、及β-catenin表达明显下调，差异均具有统计学意义(P<0.01)。

图 3

注：1：对照组；2：shRNA-ALDH1A1组。 图 3 shRNA-ALDH1A1对MK-45细胞Wnt/β-catenin信号通路影响

ALDH1A1在多种癌组织中高表达，包括胃癌组织^[5-7]。研究发现上调或下调胃癌细胞中ALDH1A1表达，可明显促进或抑制胃癌细胞的克隆形成及侵袭能力^[8-9]。siRNA干扰耐药的卵巢癌细胞的ALDH1A1表达后，与单用化疗比较，明显抑制裸鼠体内肿瘤生长及移行^[11]。表明干扰胃癌细胞中ALDH1A1表达，能明显抑制癌细胞增殖、侵袭等生物学行为。本研究结果表明转染shRNA-ALDH1A1 48 h后，能明显抑制细胞活力，降低细胞的迁移数目及侵袭数目，与已有研究结果一致^[8-9]。

肿瘤的迁移、侵袭转移等生物学行为是导致细胞外基质降解的关键步骤，主要由MMPs等蛋白水解酶所介导；其中MMP2不仅能够降解细胞外基质组成成分Ⅳ型胶原，还能通过新生的毛细血管促使肿瘤细胞转移。MMP9是MMPs中最大的分子，能够降解细胞外基质及基底膜，促进癌细胞扩散及转移。研究已证实胃癌组织中MMP2及MMP9高表达，并与淋巴结转移，分化程度等临床参数密切相关^[12]。肿瘤细胞的恶性生物学行为受多种信号通路调控，包括Wnt信号通路。Wnt信号通路是真核细胞中高度保守的一条信号通路，由β-连环蛋白(β-catenin)介导的通路是Wnt信号通路中的经典信号通路。正常条件下，β-catenin处于细胞质中，当受上游信号刺激后，并经一系列信号传导，使得β-catenin向细胞核转移，进而促进下游靶基因的表达。ALDH1A1能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路提高阳性前列腺癌治疗效果^[13]。通过抑制Wnt/β-catenin信号通路，下调MMP2及MMP9表达，从而抑制细胞的迁移侵袭能力^[14]。提示，通过下调ALDH1A1表达，进而抑制Wnt/β-catenin信号通路，可遏制肿瘤细胞的迁移及侵袭能力。

本研究结果显示，shRNA-ALDH1A1转染后，随着MK-45细胞中ALDH1A1表达量下调，细胞中MMP2、MMP9表达受到明显抑制，同时Wnt1、Wnt5a及β-catenin表达也受到明显抑制。提示，干扰ALDH1A1表达可明显降低胃癌细胞MKN-45活力、并抑制其迁移、侵袭，其机制可能与Wnt/β-catenin信号通路抑制有关。