西藏前藏地区调查发现，这一地区的人群某些骨发育不良疾病明显高于平原地区^[1-4]，这些骨发育不良疾病多属于罕见病。这些罕见病发病机制探讨倍受关注。研究表明，中波紫外线(ultraviolet B，UVB)对上皮细胞具有损伤作用^[5]。为探讨细胞损伤机制，本研究采用不同剂量紫外线对人永生化表皮细胞(HaCaT)进行照射，通过细胞凋亡实验及彗星实验分别检测细胞凋亡率及细胞DNA损伤情况，旨在为探讨高原罕见病发生机制提供理论依据。结果报告如下。

HaCaT细胞(中科院上海细胞库)；杜尔伯科极限必需培养液(Dulbecco minimum essential medium，DMEM)(美国Gibeco公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、彗星实验试剂盒(南京凯基生物公司)，青链霉素、胰酶(北京Soliabo公司)。流式细胞仪(美国BD公司)，荧光显微镜(日本Olympus公司)，水平电泳槽(北京六一仪器厂)，紫外线光源(广东佛山照明公司)，紫外线强度测量仪(深圳欣宝瑞仪器有限公司)。

将HaCaT细胞接种于培养瓶，用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM培养基，培养于37 ℃、5%CO₂的培养箱中。每2~3 d换液，待细胞长至80%融合时进行实验。

将细胞消化，调整密度为2×10⁵个/mL，接种在6孔培养板，每孔1 mL，每组5个复孔，共设4组，分别为对照组、10、30、60 mJ/cm²紫外线照射组；照射前小心吸去培养基，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗2~3遍，加入少许PBS液刚好覆盖孔底，将板置于中波紫外线灯下15 cm 处，按预先设定好的剂量照射，对照组除不进行照射外其余条件与照射组一致。照射后加入原培养基继续培养12 h。

采用流式细胞术，消化细胞制成悬液收集于离心管内，使细胞数目不少于1×10⁵个，1 000 r/min离心5 min。加入预冷PBS，洗涤细胞2次(1 000 r/min，5 min)。各管中加入500 μL的binding buffer悬浮细胞，轻柔吹打成细胞悬液。避光条件下，除调零组外各管中加入5 μL annexin V fluorescein isothiocyanate(FITC)，充分混匀，室温反应5~15 min。用300目尼龙过滤网过滤各管细胞悬液置于样品管中。除调零组外每管中各加入5 μL propidium iodide(PI)，1 h内上机检测。

细胞用冰冷 PBS洗1次，离心收集，用PBS重悬使其密度为1×10⁴个/mL；在载玻片上自制大小为15 mm×12 mm×2 mm 小槽 ，按照试剂盒说明铺胶；将盖玻片移去，放置载玻片于平皿中，将预冷lysis buffer倒入(使用前每9 mL加入1 mL二甲基亚砜)，4 ℃环境下裂解1~2 h，倒掉lysis buffer，用PBS轻轻漂洗载玻片；将载玻片平放于水平电泳槽，倒入刚配制的电泳碱性缓冲液，加至载玻片胶面以上0.25 cm左右，室温环境下解旋20~60 min；将直流稳压电源电压调至 25V，时间设为20~30 min；在器皿中加入0.4 mol Tris-HCl(pH7.5)缓冲液，电泳完毕将载玻片取出置于器皿中，4 ℃环境下中和3次，每次10 min，取出载玻片用吸水纸轻轻擦拭剩余缓冲液。滴加20 μL PI染液覆盖小槽，盖上盖玻片，避光染色10 min；荧光显微镜下观察，515~560 nm波长激发光、PI染色的DNA图像呈红色，观察核DNA和迁移DNA(即彗星尾)；图像用CASP软件分析，测定彗星尾矩(tail moment,TM)、Olive尾矩(olive tail moment,OTM)，表示DNA损伤情况。

计量资料采用x±s表示，应用 SPSS 17.0 软件进行统计分析，组间比较采用Dunnet-t法，以P<0.05为差异有统计学意义。

与对照组比较，10、30、60 mJ/cm²剂量照射组HaCaT细胞早期、晚期凋亡率均明显增加，差异均有统计学意义(F=326.39、1867.16，P<0.05)，呈剂量依赖性。

表 1

表 1 紫外线对HaCaT细胞凋亡影响(%，x±s，n=5) 组别(mJ/cm2) 早期凋亡率 晚期凋亡率 对照组 1.20±0.14 2.00±0.13 UVB 10 2.23±0.37a 7.63±0.52a 30 4.13±0.29ab 23.36±0.98ab 60 5.97±0.17abc 40.46±1.39abc 注：与对照组比较，a P<0.05；与10 mJ/cm2组比较，b P<0.05；与30 mJ/cm2组比较，c P<0.05。

表 1 紫外线对HaCaT细胞凋亡影响(%，x±s，n=5)

结果显示，对照组细胞无明显拖尾现象(图 1A)，10 mJ/cm²剂量紫外线照射组细胞可见拖尾现象(图 1B)，30 mJ/cm²剂量紫外线照射组细胞拖尾现象明显，60 mJ/cm²剂量紫外线照射组细胞拖尾最长。与对照组比较，各剂量UVB组HaCaT细胞尾矩和Olive尾矩明显延长，差异有统计学意义(F=259.35、637.64，P<0.05)；随着照射剂量增加，尾矩和Olive尾矩逐渐增大，存在剂量依赖性。

图 1

注：A:对照组；B、C、D：10、30、60 mJ/cm2UVB组。 图 1 UVB对HaCaT细胞DNA损伤影响

表 2

表 2 紫外线对HaCaT细胞DNA损伤影响(x±s=5) 组别(mJ/cm2) TM OTM 对照组 0.13±0.25 0.32±0.47 UVB 10 21.78±2.31a 16.17±1.96a 30 53.48±5.66ab 36.43±2.89ab 60 79.16±7.47abc 51.71±1.87abc 注：与对照组比较，a P<0.05；与10 mJ/cm2组比较，b P<0.05；与30 mJ/cm2组比较，c P<0.05。

表 2 紫外线对HaCaT细胞DNA损伤影响(x±s=5)

紫外线是波长为100~400 nm的光辐射。其中中、长波紫外线对人体生理功能影响较大，中波紫外线(UVB)因可直接被细胞DNA吸收，危害更大。紫外线属非电离化辐射，作用于细胞后，其光子能量被原子或分子吸收，引起分子原子电子能级状态改变，进而导致细胞内相关事件出现。核酸和蛋白质分别在波长为260 nm和278 nm处有吸收峰，正处于紫外线波长范围，因此紫外辐射对细胞损伤作用常体现在与生物大分子有关的细胞增殖和凋亡方面^[6-8]。紫外线诱导的细胞损伤研究已成为细胞生物学、分子生物学领域的研究热点之一。紫外线空间分布主要与地理纬度、地势高度、云层散射等因素有关^[9]。在中国，冬季青藏高原、云南地区紫外辐射强度最高，华南地区次之，处于高纬度的东北和新疆北部最低。夏季青藏高原地区紫外线辐射量最大，西北明显高于东南，中纬度地区高于低纬度和高纬度地区。其余月份总体呈现西部高于东部，西北大于东南^[9-10]。

环境污染所致臭氧层破坏可引起紫外线辐射增多。人类现代工业生产生活排放的大量化学物质如有机溴化物及氯氟烃类化合物加速了臭氧层破坏，使得大气平流层臭氧破坏加重。虽然人类已经意识到臭氧层破坏的严重性，开始重视环境保护，但臭氧浓度在北半球依旧在降低^[11]，2011年北极臭氧浓度显著下降^[12-13]，预计2015—2019 年地球平流层臭氧浓度将降至最低^[14]。透过北极的紫外线可对整个北半球人类的生活产生重要影响^[15]。中纬度地区由于臭氧浓度减少，紫外线辐射带来的压力增加^[16-17]，尤其是中波紫外线方面^[18]。在过去几十年中，北半球中纬度地区的地表中波紫外线辐射强度增加了大约5%^[19]。有研究者预测，在中国，臭氧总量将会以线性趋势减少，到2030年会达到最低值，预计在20年内不会好转^[20]。

本研究结果显示，以10、30、60 mJ/cm² UVB作用于体外培养的HaCaT细胞，与对照组比较，HaCaT细胞早期、晚期凋亡率及总凋亡率均随着照射剂量增加逐渐增加。与已有研究结果^[21]一致。单细胞凝胶电泳实验显示，经紫外线照射后HaCaT细胞出现拖尾现象，剂量越大，拖尾越严重，表明DNA损伤越严重；与对照组比较，紫外线照射组HaCaT细胞尾矩和olive尾矩均明显延长，呈剂量效应关系。提示，紫外线照射导致DNA损伤可能是细胞凋亡、细胞生长抑制作用机制之一；UVB可使细胞DNA产生损伤，诱导细胞发生凋亡；而细胞DNA损伤可能是某些高原罕见病的发病原因之一。