中国公共卫生  2016, Vol. 32 Issue (10): 1326-1329   PDF    
引用本文
焦仕林, 朱培蕾, 姜朴, 曾欣, 罗启芳, 王琳. 蜡样芽孢杆菌还原六价铬效果分析[J]. 中国公共卫生, 2016, 32(10): 1326-1329.
JIAO Shi-lin, ZHU Pei-lei, JIANG Pu, et al . Reduction of hexavalent chromium by Bacillus cereus Cr4-1[J]. Chinese Journal of Public Health, 2016, 32(10): 1326-1329.
蜡样芽孢杆菌还原六价铬效果分析
焦仕林, 朱培蕾, 姜朴, 曾欣, 罗启芳, 王琳     
华中科技大学同济医学院公共卫生学院环境医学研究所教育部环境与健康重点实验室, 湖北 武汉 430030
收稿日期: 2016-04-07; 数字出版日期: 2016-06-21.
基金项目: 国家自然科学基金（81273022）
作者简介: 焦仕林(1990-),男,湖北人,硕士在读,研究方向:环境生物修复技术。
通讯作者: 王琳,E-mail:lwangtj@126.com
摘要: 目的 探索蜡样芽孢杆菌Cr4-1对六价铬[Cr（Ⅵ）]的还原特性。 方法 采用正交试验研究温度、pH、初始Cr（Ⅵ）浓度、摇床转速对细菌生长和Cr（Ⅵ）还原的影响；使用9种常见碳源进行细菌生长和Cr（Ⅵ）还原试验，筛选最佳碳源和电子供体；采用透射电子显微镜观察不同浓度Cr（Ⅵ）还原细菌，细菌前后形态的变化。 结果 影响该细菌生长的主要因素是摇床转速和pH值，影响Cr（Ⅵ）还原细菌的主要因素是初始Cr（Ⅵ）浓度和温度。细菌生长和Cr（Ⅵ）还原的较优条件是温度35℃、pH=9、初始Cr（Ⅵ）浓度为30 mg/L、转速150 r/min。乳酸钠是细菌生长和Cr（Ⅵ）还原的较好碳源，其次是丙酮酸钠。透射电镜观察发现，初始Cr（Ⅵ）浓度为30 mg/L和60 mg/L时，还原过程中Cr（Ⅵ）对细菌具有毒性作用，浓度越高，细菌损伤越严重。 结论 蜡样芽孢杆菌Cr4-1对Cr（Ⅵ）的还原效果明显，具有较好的应用前景。
关键词： 蜡样芽孢杆菌     六价铬还原     环境因素     碳源    
Reduction of hexavalent chromium by Bacillus cereus Cr4-1
JIAO Shi-lin, ZHU Pei-lei, JIANG Pu, et al     
Institute of Environmental Medicine, Ministry of Education Key Laboratory of Environment and Health, School of Public Health, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, Hubei Province 430030, China
Abstract: Objective To study the reduction of hexavalent chromium (Cr[Ⅵ])by Bacillus cereus (B.cereus) Cr4-1. Methods Effects of temperature,pH,initial Cr(Ⅵ) concentration and shaker speed on hexavalent chromium reduction and the growth of B.cereus were explored with orthogonal tests.Nine common carbon sources were used in the bacteria culture and Cr(Ⅵ) reduction test in order to screen the optimum carbon source and electron donor.Transmission electron microscopy was employed to observe morphological changes of bacteria Cr4-1 before and after Cr(Ⅵ) reduction. Results The main factors influencing the growth of the bacteria were shaking speed and pH value.The main factors influencing the Cr(Ⅵ) reduction were initial Cr(Ⅵ) concentration and temperature.The better conditions for the bacterial growth and Cr(Ⅵ) reduction were the temperature of 35℃,pH value of 9,initial Cr(Ⅵ) concentration of 30 mg/L,and the shaking speed of 150 r/min.Sodium lactate was the best carbon source for bacterial growth and Cr(Ⅵ) reduction,followed by sodium pyruvate.Toxic effect of Cr(Ⅵ) on B.cereus Cr4-1 strain during Cr(Ⅵ) reduction process at the initial Cr(Ⅵ) concentration of 30 and 60 mg/L was observed with transmission electron microscope and the effect was positively correlated with the initial Cr(Ⅵ) concentration. Conclusion Bacillus cereus Cr4-1 presents good efficiency in bioreduction of hexavalent chromium and could be used in practical application.
Key words: Bacillus cereus     hexavalent chromium reduction     environmental factor     carbon source    

铬(chromium,Cr)在生产和应用过程中可对环境带来严重污染,其中六价铬 可通过消化道、呼吸道、皮肤及粘膜侵入人体，损伤肝肾等器官，同时具有较强的遗传毒性、生殖毒性和致癌作用，严重危害人体健康[1-2]。因此，将Cr(Ⅵ)还原为低毒的Cr(Ⅲ)具有重要的实际意义。Cr(Ⅵ)还原目前已知的方法主要有化学还原和离子交换法。前者会产生大量污泥，后者在其他重金属离子存在时缺乏特异性[3]。近年来，随着生物修复技术的发展，用细菌还原六价铬的方法引起了重视[4]。本研究于2014年3月从湖北省某铬盐厂污水处理站含Cr(Ⅵ)的活性污泥中，通过驯化培养，筛选获得1株还原Cr(Ⅵ)的蜡样芽孢杆菌Cr4-1。现将环境因素、碳源和电子供体对细菌生长和Cr(Ⅵ)还原效果的影响报告如下。

1 材料和方法 1.1 主要试剂与仪器

LB培养液：胰蛋白胨10 g/L,酵母提取5 g/L，氯化钠10 g/L； 无机盐培养液：1.013 g/L 氯化铵，0.62 g/L磷酸二氢钠,2.5 g/L磷酸氢二钾,0.010 3 g/L硫酸镁,0.004 25 g/L氯化钙,氯化铁0.000 85 g/L[5-6]。本研究中所用试剂纯度均为分析纯。722N分光光度计(上海菁华科技有限公司)；150-A数显生化培养箱(常州国华电器有限公司)；TH2-103B恒温培养摇床 (上海一恒科技有限公司)；Neofuge 23R台式高速冷冻离心机(香港力康发展有限公司)；HFsafe 1200/C生物安全柜(深圳力康发展有限公司)、Tecnai G212透射电子显微镜(荷兰FEI公司)。

1.2 Cr(Ⅵ)还原菌株

于2014年3月采集湖北省某铬盐厂污水处理站活性污泥进行驯化、分离和纯化，获得1株高效Cr(Ⅵ)还原的蜡样芽孢杆菌株，命名为Cr4-1。该菌即为后续Cr(Ⅵ)还原特性研究的菌种[7]。

1.3 Cr4-1生长和还原较优条件筛选(表 1)

采用4因素3水平的正交试验设计(表 1)[8]筛选Cr4-1生长和还原Cr(Ⅵ)的较优条件。以细菌生长百分比和还原率作为评价指标。其中细菌生长百分比是指还原试验进行12 h之后的细菌密度和初始细菌密度的比值；还原率是还原实验进行12 h之后，被还原的Cr(Ⅵ)浓度和初始Cr(Ⅵ)浓度的比值。

表 1 正交设计因素

1.4 不同碳源和电子供体对Cr4-1生长和还原的影响

取0.1 mL Cr4-1菌液接种到装有50 mL LB培养液的锥形瓶中过夜富集培养，将细菌在6 000 r/min条件下离心5 min，用pH值为7.0的磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)溶液清洗2次，接种至装有70 mL无机盐培养液的锥形瓶中，在30 ℃、150 r/min条件下培养。培养液初始Cr(Ⅵ)浓度30 mg/L，分别加入不同碳源，检测细菌600 nm处吸光度值和剩余Cr(Ⅵ)浓度。所选择的碳源包括乳酸钠、 葡萄糖、乙醇、甘油、丙酮酸钠、柠檬酸钠、琥珀酸钠、醋酸钠和甲酸钠等。采用不加碳源但接种细菌的无机盐培养液作为对照。每个样品进行3个平行试验。

1.5 Cr(Ⅵ)对菌株Cr4-1的损伤

将Cr4-1接种在初始Cr(Ⅵ)浓度为30 mg/L和60 mg/L的培养液中，培养24 h。取0.5 mL的Cr4-1菌液，6 000 r/min离心5 min，弃去上清液，用2.5%戊二醛固定细菌2 h，然后用0.1 mol/L的PBS清洗2次，每次20 min，用1%的锇酸固定30～120 min，再次用0.1 mol/L的PBS清洗，按50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇丙酮、90%丙酮、100%丙酮(2次)各 5 min 梯度脱水，丙酮和环氧树脂1∶ 1，混合浸透2 h，纯环氧树脂包埋剂浸透2 h，开始包埋，在80 ℃恒温箱内聚合10 h，修块，用德国LEICA ULTRACUT UCT超薄切片机切片，醋酸双氧铀、枸橼酸铅双重染色各10 min，最后在透射电子显微镜下观察并拍照记。对照为不加Cr(Ⅵ)，接种相同浓度和体积的Cr4-1 菌液。

1.6 分析方法

Cr(Ⅵ)测定采用二苯基碳酰二肼分光光度法[9]。细菌浓度的测定采用600 nm处吸光度值。

1.7 统计分析

正交实验中，采用极差分析法，计算K值和R值。K值为不同因素不同水平的均值，R值为极差，即各因素中最大K值和最小K值的差值。因此，K值用来确定不同因素的最佳水平。R值反映不同因素对于实验结果的影响程度。采用SPSS 18.0软件进行统计分析。

2 结 果 2.1 细菌生长和还原较优条件(表 2)

比较细菌生长百分比(%)和Cr(Ⅵ)还原率(%)各因素的R值大小可知，细菌生长的影响程度依次为：转速>pH值>初始Cr(Ⅵ)浓度>温度；各因素对Cr(Ⅵ)还原的影响依次为：Cr(Ⅵ)浓度>温度>pH值>转速。 比较各因素的K值大小可知，细菌生长的最佳条件为25 ℃、pH为8、初始Cr(Ⅵ)浓度30 mg/L、摇床转速150 r/min；Cr(Ⅵ)还原的最佳条件为：35 ℃、pH为9、初始Cr(Ⅵ)浓度30 mg/L、摇床转速75 r/min。由此可见，影响细菌生长最主要的因素是摇床转速和pH值，影响Cr(Ⅵ)还原最主要的因素是初始Cr(Ⅵ)浓度和温度。 当温度为35 ℃、pH值为9、初始C浓度30 mg/L、转速150 r/min时，细菌生长百分比最高达到123.1%，还原率达到100%。

表 2 菌株Cr4-1生长和还原的正交试验结果

2.2 碳源和电子供体筛选结果(图 1、2)

乳酸钠是细菌生长代谢过程中的一种常见碳源和电子供体，为获得适于Cr4-1生长的碳含量和碳氮比，首先选用不同浓度乳酸钠进行细菌生长和Cr(Ⅵ)还原试验。从图 1A可以看出，当乳酸钠浓度较低时，由于碳源浓度无法满足细菌生长的需求，细菌光密度(optical density，OD)值呈下降趋势，随着乳酸钠浓度的增加，细菌浓度逐渐增大，当乳酸钠浓度达到12 g/L时，细菌浓度达到最大。乳酸钠浓度为48 g/L时，可能由于碳源和氮源比例的影响，细菌生长被抑制。图 1B显示，当乳酸钠浓度为12 g/L时，细菌Cr4-1对Cr(Ⅵ)还原效果最好，可以在48 h内将30 mg/L的Cr(Ⅵ)还原至5 mg/L，还原率达到83.33%。乳酸钠浓度过高或过低，还原均会受到抑制。因此，细菌生长和还原所需的最佳乳酸钠浓度为12 g/L，此时碳含量为3.84 g/L，培养液碳氮比为14∶ 1。为便于比较，本研究选择的9种碳源，其碳含量均为3.84 g/L，碳氮比为14∶ 1，实验结果如图 2所示。从图 2A可以看出，与未加碳源对照相比，甘油、醋酸钠、琥珀酸钠、柠檬酸钠可维持细菌的生长，而乳酸钠和丙酮酸钠则可促进细菌的生长。细菌Cr4-1的较好碳源依次为乳酸钠>丙酮酸钠>葡萄糖≈甘油>琥珀酸钠>柠檬酸钠。不同碳源对Cr(Ⅵ)还原的影响如图 2B所示。有利于Cr(Ⅵ)还原的碳源依次为：乳酸钠>丙酮酸钠>葡萄糖>甘油>琥珀酸钠。可见，乳酸钠是细菌生长和Cr(Ⅵ)还原的较好碳源，其次是丙酮酸钠。葡萄糖、甘油、琥珀酸钠虽然可促进细菌生长，但对Cr(Ⅵ)还原的效果较差。

图 1 不同乳酸钠浓度对菌株Cr4-1生长和Cr(Ⅵ)还原的影响

图 2 不同碳源对细菌生长和Cr(Ⅵ)还原的影响

2.3 Cr(Ⅵ)对细菌损伤(图 3~5)

采用透射电子显微镜对Cr(Ⅵ)还原前后的细菌形态变化进行了观察。图 3是正常细菌生长24 h后的镜下形态。从图 3a上可以清楚的观察到细菌的细胞壁、细胞膜和细胞内部的微细结构。图 3b和图 3c是正常细菌不同切面的形态，细胞结构完整、形态正常，没有观察到损伤破坏。细菌在含有Cr(Ⅵ)30 mg/L和60 mg/L的LB培养液中生长24 h后，采用透射电镜观察，结果如图 4和图 5所示。可以看出，由于Cr(Ⅵ)的影响，细菌形态明显改变，出现萎缩变形，甚至溶解坏死。有些细胞破碎之后，镜下仅存留完整的细胞壁结构，部分细胞的细胞壁也被破坏。且Cr(Ⅵ)浓度为60 mg/L时，细胞溶解坏死比Cr(Ⅵ)浓度为30 mg/L时严重。以上结果表明，细菌在还原Cr(Ⅵ)的同时，Cr(Ⅵ)对细菌产生一定的毒性，且浓度越高，毒性越大。

图 3 正常细菌生长24 h后的透射电镜照片

图 4 还原初始Cr(Ⅵ)浓度30 mg/L 24 h后的细菌透射电镜照片

图 5 还原初始Cr(Ⅵ)浓度60 mg/L 24 h后的细菌透射电镜照片

3 讨 论

正交试验的优点是试验次数少、效果好、方法简单、使用方便、效率高。本研究通过4因素3水平9次试验的正交试验设计，探讨蜡样芽孢杆菌Cr4-1生长和还原Cr(Ⅵ)的影响因素，得出菌株Cr4-1生长和对Cr(Ⅵ)还原的较优条件为：35 ℃、pH值为9、初始铬浓度30 mg/L、转速150 r/min。目前，筛选Cr(Ⅵ)还原菌及其还原Cr(Ⅵ)影响因素的研究中，由于筛选的方法不同、得到的菌种不同、环境因素的差异，得到的结果存在差异[10-12]。本研究发现乳酸钠和丙酮酸钠是细菌生长和Cr(Ⅵ)还原的较好碳源，同时发现葡萄糖、甘油、琥珀酸钠对菌株Cr4-1的生长与还原也有较好的促进效果，这与魏斐等[13]研究结果相似，加之所选择的碳源价格便宜，容易获得，在废水中比较常见，比如葡萄糖常见于食品加工废水[14]，故它们作为菌株Cr4-1的碳源和电子供体可行且经济实用。

细菌还原六价铬的机制一般认为有直接还原和间接还原2种。直接还原是利用细菌分泌的铬还原酶催化还原Cr(Ⅵ)，这种酶可能位于胞外、胞内或者胞膜上，是细菌的一种主动防御机制[15]。间接还原是细菌在代谢过程中产生一些还原性物质，如硫化氢等，可直接与Cr(Ⅵ)反应，达到解毒目的，间接还原的细菌一般为自养型细菌。蜡样芽孢杆菌Cr4-1为异养型细菌，而且在还原试验的过程中，并未发现硫化氢等还原性物质的产生。因此，可以初步推测，细菌Cr4-1对Cr(Ⅵ)的还原为酶介导反应。有文献表明,细菌溶解在六价铬还原过程中起到重要的作用,细菌溶解所释放的构酶可以在胞内或者胞外催化Cr(Ⅵ)[16-17]。蜡样芽孢杆菌Cr4-1也可能具有类似的还原机制。由于Cr(Ⅵ)的毒性作用，细菌发生溶解坏死，释放出Cr(Ⅵ)还原酶还原Cr(Ⅵ)。但Cr(Ⅵ)如何介导细菌的溶解尚有待进一步研究。

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