熊果酸又名乌索酸、乌苏酸，属于α－香树脂醇型非极性的五环三萜类化合物，是女贞子、山楂、陆英等多种药用植物中的重要化学成分，具有抗糖尿病^[1]、降脂^[2]、抗炎^[3]、免疫调节^[4]、抗心血管疾病^[5]等多种生物学效应，许多含有熊果酸的中药材在临床用于保肝、镇痛、强心等方面。近年来研究发现，熊果酸具有预防肿瘤形成、诱导肿瘤细胞凋亡、阻滞肿瘤细胞增殖周期、诱导肿瘤细胞分化、防止肿瘤细胞侵袭转移等作用^[6-12]。但由于熊果酸具有强疏水性，其生物利用度很低；另外，含有羧基的药物对胃肠道刺激较大，而且羧基在人体中的代谢不稳定，限制其应用。研究表明，熊果酸3位羟基和17位羧基是熊果酸维持抗肿瘤活性的关键基团^[13]。虽从熊果酸母体结构入手进行化学修饰和结构改造，设计合成了许多有效的熊果酸衍生物^[14-17]，但是这些衍生物并不能完全改善熊果酸在水中的溶解度。本研究利用赖氨酸与熊果酸成盐，观察在水中溶解度及对人肝癌Bel7402肿瘤细胞的体外抑制作用，旨在为熊果酸的进一步开发利用提供技术支持。

人肝癌细胞株bel7402(中国医学科学院肿瘤医院)；1640培养基(上海博耀生物科技有限公司)；熊果酸(南京泽朗医药科技有限公司，纯度≥98.5％)；赖氨酸(北京欣经科生物技术有限公司)；熊果酸对照品(中国食品药品检定研究院，110742~201220)；乙腈(色谱纯，美国 Fisher CHEMICAL 有限公司)。 Bruker D8 ADVANCE 粉末衍射仪(德国布鲁克有限公司)；Nicolet 5700型傅里叶变换红外光谱仪(美国Thermo Nicolet公司)；Angilent 1200 高效液相色谱仪(美国安捷伦有限公司)，WD－2102A型酶标仪(北京六一仪器厂)。

精密称取等摩尔比的熊果酸(2 283.50 mg)与赖氨酸(730.95 mg)混合均匀，于25 ℃置于球磨机中研磨12 h，收集产物，即得白色粉末状赖氨熊果酸(2 868.34 mg)，得率为95.2%，经高效液相色谱(HPLC)检测其纯度为98.2%。

X 射线衍射图谱的摄取采用粉末衍射仪，测定条件为vertical goniometer，Ni-filter单色器，Theta/Theta连续扫描，电压40 kV，电流40 mA，扫描速度8°/min，LynxEye 检测器，扫描范围3°～80°。

采用衰减全反射傅立叶变换红外光谱仪(attenuated total reflectance-fourier transform infrared spectroscopy,ATR-FTIR)测定，光谱范围4 000～650 cm^-1，分辨率为4.000 cm^-1，扫描次数16次，测定红外吸收光谱。

HPLC色谱柱为Agilent Eclipse XDB C₁₈(250×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈：水＝90：10；流速为1.0 mL/min；柱温为30 ℃；进样量为10 μL；检测波长为210 nm。

精密称取熊果酸对照品25.10 mg，移至25 mL容量瓶中，使用甲醇溶剂定容，配制成浓度为1 004.0 μg/mL储备液。精密吸取0.05、0.10、0.50、1.00、2.50、5.00 mL至10 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，获得6种浓度样品，分别为5.00、10.04、50.20、100.40、251.00、502.00 μg/mL。分别精密吸取6种浓度溶液各10 μL 注入液相色谱仪，重复进样3次，记录色谱图及峰面积，以样品浓度数据为横坐标，以检测获得的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

精密量取浓度为251.00 μg/mL的熊果酸溶液 10 μL注入液相色谱仪，重复进样6次，记录色谱图及峰面积，计算样品平均峰面积相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)。

精密量取熊果酸溶液，分别于0、1、2、4、8、12 h取10 μL注入液相色谱仪，每个样品平行进样3次。记录色谱图及峰面积，计算RSD值。

分别称取过量熊果酸、赖氨熊果酸、赖氨酸-熊果酸物理混合物悬浮于20 mL水中，置于水平摇床中，在25 ℃下震摇8 h，分别于1、2、3、4、6、8 h取样，取样后以水补足溶液量，样品溶液经0.22 μm滤膜过滤后上HPLC检测。

采用3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)比色法^[18-21]，人肝癌细胞株bel7402，以含体积分数10%胎牛血清，100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的1640培养基，在37 ℃、5%CO₂、饱和湿度下培养，24 h后细胞贴壁生长，每3~4 d传代1次，取对数生长期的bel7402细胞制成2×10⁵个/mL的细胞悬液，加入96孔培养板中，每孔200 μL，待细胞贴壁生长后弃去培养液；二甲亚枫(DMSO)溶解，1640培养液分别稀释熊果酸、 赖氨熊果酸、5-氟尿嘧啶(5-FU，阳性对照)至终浓度为5、10、20、40、80 μmol/L，空白孔加入1640培养液，对照组加入0.1% dimethylsulphoxide (DMSO)； 每个浓度设3个平行孔；采用酶标仪在490 nm处测定吸光度(A)值，空白孔调零，取平均值，计算细胞生长抑制率。

Powder X-ray diffraction (PXRD)图谱显示，熊果酸属晶态化合物，具有尖锐的特征衍射峰； 赖氨酸属于结晶度较差的晶态化合物，赖氨酸、熊果酸(1∶ 1)物理混合物的主要衍射峰含有熊果酸和赖氨酸的衍射峰，为2种成分衍射峰的物理叠加； 赖氨熊果酸为非晶态化合物，因而无明显尖锐衍射峰，表现为弥散衍射峰，表明通过研磨过程赖氨酸与熊果酸形成了新的物相赖氨熊果酸。

图 1

图 1 赖氨熊果酸粉末X射线衍射分析图谱

熊果酸具有乌苏烷型骨架，分子中存在特征的偕二甲基及羧基，这些结构在IR谱图上均可得到确认。波数1 383和1 375 cm^-1处的特征双峰为C-4连接的偕二甲基的C-H面内弯曲振动吸收；1 710 cm^-1附近为C-28羧基的υ_C=O吸收；在波数3 521和999 cm^-1附近分别可见C-3羟基的伸缩振动吸收和面外弯曲振动吸收。赖氨酸在IR谱图上可见-NH₃的弯曲振动吸收(1 573 cm^-1)和-COO-的对称伸缩振动吸收(1 404 cm^-1)；赖氨酸与熊果酸物理混合物的红外光谱差别不大；赖氨熊果酸的IR谱图中C-28羧基的υ_C=O吸收减弱，1 029 cm^-1附近出现强 υ_C－O－C 伸 缩振动峰。提示，成盐反应是通过熊果酸的C-28羧基与赖氨酸结构中氨基进行的。

图 2

图 2 赖氨熊果酸傅立叶红外光谱分析图谱

performance liquid chromatography (HPLC)图谱(图 3) HPLC分析表明，熊果酸溶液在5.00 ~ 502.00 μg/mL浓度范围内，回归线性方程为Y=4.729X+5.732，相关系数R²=1.000(n=6)，表明其线性关系良好；精密度测定结果表明，样品平均峰面积RSD为0.28%，稳定性测定结果表明，样品平均峰面积为0.86%，表明利用高效液相色谱法测定熊果酸含量方法稳定性良好。HPLC图谱显示，赖氨熊果酸与熊果酸具有相同的保留时间。提示，在溶液中赖氨熊果酸容易变回熊果酸，因此具有熊果酸的相应特性，可发挥相应的生物活性。

图 3

图 3 赖氨熊果酸HPLC分析图谱

分别将熊果酸、赖氨熊果酸、赖氨酸-熊果酸物理混合物的饱和溶液取样10 μL进样，重复测定3次，取平均值，以峰面积计算熊果酸的含量。结果表明，熊果酸不溶于水，赖氨熊果酸在不同取样点的溶解度分别为48.99、49.70、49.69、49.68、49.68、49.69 μg/mL，其饱和溶解度为49.69 μg/mL，高于赖氨酸-熊果酸物理混合物在水中的溶解度1.87 μg/mL，赖氨熊果酸成盐后明显改善了熊果酸的水溶性。

浓度在5~80 μmol/L范围内，赖氨熊果酸对肿瘤细胞具有明显抑制作用，呈剂量依赖性；当浓度为10、20 μmol/L时，与5-fluorouracil (5-FU)(阳性对照)比较，赖氨熊果酸对肿瘤细胞的抑制作用差异无统计学意义(P＞0.05)。

表 1

表 1 赖氨熊果酸对肝癌bel7402细胞增殖抑制作用(%，x±s=3) 组别 浓度 (μmol/L) 0(对照) 5 10 20 40 80 熊果酸 0 5.1±2.7 13.9±3.3 29.4±2.5 41.8±1.2 51.3±1.8 赖氨熊果酸 0 18.6±3.7a 55.4±2.5a, 58.5±2.2a, 67.8±2.7a 81.5±1.7a 5-FU 0 28.5±2.8b 54.4±1.2 60.4±1.7 78.6±2.1b 98.8±2.0b 注：与熊果酸比较，a P<0.05；与赖氨熊果酸比较，b P＜0.05。

表 1 赖氨熊果酸对肝癌bel7402细胞增殖抑制作用(%，x±s=3)

近年来，植物来源的药物倍受重视。中国植物资源丰富，中草药中含有大量的天然活性成分，许多具有生物活性的天然产物由于其水溶性差，限制了进一步开发和利用。赖氨酸同时具有羧基和氨基，容易形成兼性离子，可以利用羧基或氨基与极性基团及水分子形成氢键，从而带动熊果酸在水中溶解，增加熊果酸在水中的溶解度。熊果酸抗肿瘤作用的优势主要在于它在抑制肿瘤细胞的同时，不仅少见不良反应，还能在一定程度上提高机体免疫力，因此受到人们的广泛关注。本研究采用研磨法制备赖氨熊果酸，利用赖氨酸的水溶性，提高熊果酸的溶解度，结果显示，通过成盐反应，赖氨熊果酸的溶解度明显改善。本研究结果还表明，通过与赖氨酸成盐，熊果酸对肝癌bel7402细胞的抑制作用明显提高，其具体机制值得进一步探讨。