硒是人体必需微量元素，2009年卫生部将甲基硒代半胱氨酸，即L-硒-甲基硒代半胱氨酸(L-Se-methylselenocysteine，MSC)列为新型食品营养强化剂。MSC是一种天然含硒氨基酸-硒代半胱氨酸的甲基化衍生物，具有防治癌症、抗氧化、抗衰老、治疗心脑血管疾病、拮抗重金属中毒等作用^[1]。硒在机体最主要功能是抗氧化，此外还可促进机体免疫功能、调控基因表达、参与多种疾病的发生发展。本研究以人乳腺癌MDA-MB-231细胞为受试对象，探讨MSC对乳腺癌细胞的抑制作用及可能机制，结果报告如下。

人乳腺癌MDA-MB-231细胞株(徐州医学院肿瘤实验室)；胎牛血清(杭州四季青公司)；1640培养基(美国GIBCO公司)；MSC(美国Sigma公司)，将MSC配制为100 mmol/L的储存液，-20 ℃储存，使用前以1640完全培养基稀释成不同浓度溶液；噻唑兰(3-(4，5-dimethylthiozol-2-yl)-2, 5 diphenyltetrazolium bromide, MTT)(美国Amersco公司)；细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)检测试剂盒(上海碧云天公司)。酶标仪(美国Bio-Tek公司)。

采用MTT法，接种细胞10⁴个/孔至96孔板，至对数生长期时，给予200 μL不同浓度MSC溶液(12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μmol/L)，对照组加入培养液，每组设5个复孔。分别培养24、48 h后弃去培养基，加入MTT混合液200 μL，继续孵育4 h，加入200 μL二甲基亚砜，采用酶标仪在490 nm测定吸光度absorbency(A)值。细胞存活率(%)=(MSC组A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值)×100%，实验重复3次。

采用Hoechst染色法，细胞接种于6孔板上，分组与处理同1.2.1，分别培养24、48 h后吸尽培养液，加入0.5 mL固定液，固定10 min，去固定液，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline)洗2遍；加入0.5 mL Hoechst染色液5 min，PBS洗2遍，吸尽液体；每孔滴1滴抗荧光淬灭封片液，盖上盖玻片；荧光显微镜检测呈蓝色的细胞核。

细胞接种于6孔板上，分组与处理同1.2.1，分别培养24、48 h，4 ℃PBS洗涤1~2遍，细胞裂解液裂解细胞，吸出裂解液至离心管，4 ℃离心取上清，用试剂盒分别检测SOD、MDA、GSH-Px水平，按试剂盒说明书操作。

计量数据符合正态分布的用表示，采用SPSS 16.0软件进行统计分析，组间均数比较采用方差分析，资料满足方差齐性时，多实验组与同一对照组均数间两两比较采用Dunnett′s t检验，不满足方差齐性时，采用Dunnett′s T3检验；P < 0.05表示差异有统计学意义。

表 1

表 1 MSC对MDA-MB-231细胞存活率影响(%，x±s，n=5) 组别(μmol/L) 培养时间(h) 24 48 对照组 100.00±0.00 100.00±0.00 MSC 12.5  95.71±0.98  95.41±1.27     25.0  89.08±1.86ab  84.81±0.85ab     50.0  85.18±1.65ab  78.00±1.39ab    100.0  80.41±3.01ab  67.87±2.47ab    200.0  64.15±2.81ab  42.57±2.25ab   注：与对照组比较，a P < 0.01；与12.5 μmol/L组比较，b P < 0.01。

表 1 MSC对MDA-MB-231细胞存活率影响(%，x±s，n=5)

倒置显微镜下MDA-MB-231为梭状细胞，轮廓清楚，细胞间结构紧密，胞质透亮，生长旺盛。MSC处理组细胞缩小变圆，细胞间接触变松，颗粒样物质变多，折光性及贴壁能力减弱，增殖减慢。与对照组比较，MSC处理24、48 h时，≥ 25 μmol/L MSC组细胞存活率逐渐降低，差异均有统计学意义(F=1083.220，P < 0.01)；与24 h相比，MSC作用48 h细胞存活率差异有统计学意义(F=287.538，P < 0.01)。

图 1

注：A：对照组；B~F：MSC 12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μmol/L组。 图 1 不同浓度MSC作用MDA-MB-231细胞24 h时细胞凋亡情况(Hoechst染色，×250)

染色质凝聚是细胞凋亡典型的形态学变化之一。荧光显微镜观察结果显示，对照组细胞核呈圆形或椭圆形，为弥散均匀的蓝色荧光，强度较弱；MSC处理细胞24 h时，随着浓度升高，部分细胞核呈不同程度致密浓染或碎块状致密浓染，出现核固缩，荧光强度增强，颜色发白；处理48 h时，各处理组细胞变化趋势与24 h时大致相同。

表 2

表 2 MSC对MDA-MB-231细胞SOD、GSH-Px活力、MDA水平影响(x±s，n=3) 组别(μmol/L) SOD(U/mgprot) MDA(μmol/mgprot) GSH-Px(U/mgprot) 24 h 48 h 24 h 48 h 24 h 48 h 对照组 82.47±1.99 36.57±0.76 5.80±0.11 6.06±0.16 46.69±0.55 47.08±0.54 MSC 12.5 74.37±1.24 32.58±0.73 6.23±0.06 6.45±0.08 44.91±0.38 45.51±1.22     25.0 53.42±2.32ab 29.92±1.64a  9.78±0.26ab 12.43±0.25ab 40.43±0.84ab 35.69±0.69ab     50.0 50.25±2.08ab 26.76±2.18ab 12.13±0.27ab 18.54±0.27 ab 35.79±0.86ab 28.82±0.42ab    100.0 49.68±2.99ab 17.80±3.56ab 19.37±0.22ab 33.22±0.22 ab 30.54±0.94ab 21.97±0.68ab    200.0 20.99±3.03ab  6.27±1.52ab 36.20±0.25ab 53.13±0.25 ab 22.00±0.75ab 15.13±0.28ab 注:与对照组比较，a P < 0.01；与12.5 μmol/L组比较，b P < 0.01。

表 2 MSC对MDA-MB-231细胞SOD、GSH-Px活力、MDA水平影响(x±s，n=3)

与对照组比较，≥ 25 μmol/L MSC处理细胞24、48 h时，细胞内SOD、GSH-Px活力降低，MDA水平升高，差异有统计学意义(F=144.507、29 479.461、1 336.564，均 P < 0.01)，呈剂量效应关系；随MSC作用时间延长，细胞内SOD、GSH-Px活力逐渐降低，MDA水平逐渐升高(F=727.304、8 954.261、376.145，均 P < 0.01)，呈时间效应关系。

硒具有广泛的生物学活性，可增强人体免疫力，对部分重金属中毒有拮抗作用，而硒的抗肿瘤作用已成为目前研究热点^[2-4]。硒通过甲基化代谢可以降低硒的毒性，硒甲基化后具有很强的抗肿瘤作用^[5-6]。本研究结果表明MSC能够抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖，存在时间-剂量依赖性。超氧化物歧化酶(SOD)能够清除生物氧化过程中产生的超氧化物自由基，是生物抗氧化系统的重要酶类之一^[7]。谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)是机体内广泛存在的一种重要的含硒过氧化物分解的酶，能特异地催化还原型谷胱甘肽(GSH)对氢过氧化物的还原反应。而MDA通过酶系统和非酶系统产生氧自由基，后者能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化作用，并由此形成脂质过氧化物，使组织细胞受损伤。本研究结果显示，MSC能降低MDA-MB-231细胞内SOD和GSH-Px活力，升高MDA水平，呈剂量-时间效应。提示MSC可通过降低细胞内SOD、GSH-Px活性，升高MDA水平，造成MDA-MB-231细胞内的氧化应激状态，引起细胞氧化损伤，从而诱导细胞凋亡。这与目前已有的肿瘤细胞凋亡的氧化应激调控机制研究结果相符^[8-10]。