中国公共卫生  2016, Vol. 32 Issue (9): 1179-1182   PDF    
引用本文
王瑞, 汤佳佳, 潘姣娇, 孙倩, 黄益凡, 刘重斌. 大蒜素对多氯联苯诱导肌细胞GLUT4蛋白表达影响[J]. 中国公共卫生, 2016, 32(9): 1179-1182.
WANG Rui, TANG Jia-jia, PAN Jiao-jiao, et al . Effect of allicin on PCBs-induced GLUT-4 expression in skeletal muscle tissue of mice[J]. Chinese Journal of Public Health, 2016, 32(9): 1179-1182.
大蒜素对多氯联苯诱导肌细胞GLUT4蛋白表达影响
王瑞1, 汤佳佳1, 潘姣娇1, 孙倩1, 黄益凡1, 刘重斌1,2     
1. 湖州师范学院医学院生理与药理学教研室, 浙江 湖州 313000 ;
2. 温州医科大学基础医学院
收稿日期: 2014-11-17; 数字出版日期: 2015-10-09 8:22
基金项目: 浙江省自然科学基金（Y2110388）；浙江省科技厅公益性应用研究项目（Y2011C37091）
作者简介: 王瑞(1987-), 女, 湖南岳阳人, 助理实验师, 硕士, 研究方向:营养生理学。
通讯作者: 刘重斌, E-mail:liuchongbin1972@126.com
摘要: 目的 探讨大蒜素（allicin）对多氯联苯（PCBs）诱导小鼠骨骼肌细胞氧化应激及葡萄糖转运蛋白-4（GLUT-4）表达的影响。 方法 50只健康成年小鼠随机分为对照、多氯联苯、大蒜素（30、40、60 mg/kg）组，每组10只；连续给予30 d，取小鼠骨骼肌（股薄肌和肱三头肌），显微观察骨骼肌细胞形态，化学比色法检测骨骼肌组织丙二醛（MDA）含量及总超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和过氧化氢酶（CAT）活力，免疫组化检测GLUT-4表达量。 结果 多氯联苯组小鼠骨骼肌纤维排列紊乱，肌细胞肿胀，横纹基本消失；与对照组比较，多氯联苯组小鼠股薄肌和肱三头肌组织中MDA含量[分别为（19.15 ± 2.73）与（22.19 ± 3.72）nmol/mgprot]明显增加（P < 0.05），股薄肌与肱三头肌T-SOD、GSH-Px、CAT酶活力[分别为（110.11 ± 15.55）、（48.55 ± 7.49）、（5.01 ± 1.79）与（102.32 ± 16.80）、（45.42 ± 10.73）、（5.43 ± 1.12）U/mgprot]明显下降（P < 0.05）；与多氯联苯组比较，40 mg/kg大蒜素组小鼠股薄肌与肱三头肌组织中MDA含量[分别为（12.17 ± 2.18）与（13.00 ±2.18）nmol/mgprot]明显下降，T-SOD、GSH-Px、CAT酶活力[分别为（145.80 ± 18.41）、（59.16 ± 11.18）、（7.27 ± 2.16）与（158.58 ± 5.02）、（75.40 ± 5.03）、（8.35 ± 0.86）U/mgprot]明显升高（P < 0.05）；与对照组比较，多氯联苯组小鼠骨骼肌GLUT-4表达减少；与多氯联苯组比较，大蒜素组小鼠骨骼肌GLUT-4表达明显升高。 结论 大蒜素对多氯联苯诱导骨骼肌细胞氧化应激及GLUT4蛋白表达具有一定的拮抗作用。
关键词： 大蒜素     多氯联苯(PCBs)     葡萄糖转运蛋白-4(GLUT-4)     氧化应激    
Effect of allicin on PCBs-induced GLUT-4 expression in skeletal muscle tissue of mice
WANG Rui1, TANG Jia-jia1, PAN Jiao-jiao1, et al     
Department of Physiology and Pharmacology, School of Medicine, Huzhou Norm University, Huzhou, Zhejiang Province 313000, China
Abstract: Objective To explore the effect of allicin on oxidative stress and glucose transporter 4 (GLUT-4) expression induced by polychlorinated biphenyls (PCBs) in skeletal muscle tissue of mice. Methods Fifty mice were randomly divided into a control group, a PCBs exposure group, and three PCBs + allicin exposure groups (30, 40, and 60 mg/kg). At the end of 30 days' treatment, the morphology of skeletal muscle tissue was obsereved; the content of maleic dialdehyde (MDA) and the activities of total superoxide dismutase (T-SOD), catalase (CAT), and glutathione peroxidase (GSH-Px) in skeletal muscle tissue were detected; and the expression of GLUT-4 was also measured with immunohistochemistry. Results Compared with the control group, the disordered arrangement, cell swelling, and disappearance of cell stripes were observed in skeletal muscle tissue of PCBs exposure group; the contents of MDA increased obviously (19.15 ± 2.73 and 22.19 ± 3.72 nmol/mg prot in gracilis and triceps, both P < 0.05); and the activities of the T-SOD, GSH-Px, and CAT decreased significantly (110.11 ± 15.55, 48.55 ± 7.49, and 5.01 ± 1.79 U/mg prot in gracilis, 102.32 ± 16.80, 45.42 ± 10.73, and 5.43 ± 1.12 U/mg prot in triceps; all P < 0.05). Compared with the PCBs exposure group, the contents of MDA obviously decreased in skeletal muscle tissue of the mice with PCBs + 40 mg/kg allicin exposure (12.17 ± 2.18 and 13.00 ± 2.18 nmol/mg prot in gracilis and triceps, both P < 0.05) and the activities of the T-SOD, GSH-Px, and CAT significantly increased (145.80 ± 18.41, 59.16 ± 11.18, and 7.27 ± 2.16 U/mg prot in gracilis, 158.58 ± 5.02, 75.40 ± 5.03, ans 8.35 ± 0.86 U/mg prot in triceps; all P < 0.05). Compared with the control group, the expression of GLUT-4 decreased in the PCBs exposure group, but obviously increased in the PCBs + allicin exposure group. Conclusion Allicin has antagonistic effect on the expression of GLUT-4 in cytoplasm of skeletal muscle cells through its anti-oxidation in mice.
Key words: allicin     polychlorinated biphenyls     glucose transporter 4     oxidative stress    

多氯联苯类化合物(polychlorinated biphenyls，PCBs)是一种稳定、高亲脂性、环境中分布广泛的化合物，对人体有明显的毒性作用[1-2]。研究表明，PCBs可由细胞色素代谢激活，导致氧化应激[3-5]，使骨骼肌细胞对葡萄糖的摄取障碍[6-8]；葡萄糖转运蛋4(glucose transporter 4, GLUT-4)是与骨骼肌细胞葡萄糖储存相关的重要葡萄糖转运体[9-14]；大蒜素(allicin)能够有效清除体内自由基，具有较强抗氧化活性[15]。本研究通过观察大蒜素对PCBs诱导小鼠骨骼肌细胞氧化应激与GLUT-4表达的影响，探讨多氯联苯类化合物对机体毒性作用机制，结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器

PCBs，分子量：328.4，纯度为98%(江苏启东宇林化工厂)，大蒜素软胶囊，纯度为95%(美国Herbalife公司)，丙二醛(maleic dialdehyde，MDA)、总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)和考马斯亮兰蛋白测定试剂盒(南京建成生物研究所)，GLUT-4抗体(北京方程生物科技有限公司)。Thermo Scientific Fluoroskan Ascen酶标仪(荷兰帕纳科公司)。

1.2 分组与处理

健康雄性ICR小鼠50只，体重(25.68±3.26)g[浙江省医学科学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK(浙)2010-5234]，小鼠按体重随机分为对照组、多氯联苯组、大蒜素(30、40、60 mg/kg)组，每组10只；多氯联苯组小鼠于腹腔注射多氯联苯(2 mg/kg，注射前先溶于0.1 mL玉米油中)，大蒜素组小鼠腹腔注射多氯联苯，同时灌胃1 mL不同剂量大蒜素，对照组灌胃等剂量玉米油，连续30 d。实验期间小鼠自由饮食饮水，温度22~25 ℃，相对湿度60%~70%，末次给药后，小鼠麻醉，立刻取肱三头肌和股薄肌-80 ℃保存待测，另取部分骨骼肌组织用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，用于免疫组织化学观察。

1.3 指标与方法 1.3.1 动物生长发育状况观察

实验期间每天观察动物一般性状和表现，实验结束时称量动物体重。

1.3.2 骨骼肌形态结构观察

小鼠麻醉后立刻取其肱三头肌和股薄肌置于4%多聚甲醛中固定，常规石蜡切片，厚度3 μm。组织切片复水后常规苏木素-伊红染色(HE)，显微镜下观察骨骼肌形态结构变化。

1.3.3 生化指标测定

将骨骼肌组织9倍稀释成10%匀浆液，1 200 g离心10 min，取上清，按照蛋白测定试剂盒说明书，测定各组织中蛋白含量；比色法测定骨骼肌组织中MDA含量；骨骼肌组织中T-SOD、GSH-Px和CAT酶活性严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3.4 GLUT-4表达测定

切片经脱腊，消除过氧化物酶活性，抗原修复后加入兔抗小鼠GLUT-4(1:100)，孵育过夜，滴加生物素化二抗，二氨基联苯胺显色，苏木精复染后观察并拍照，随机选择3个视野计数，GLUT-4表达以细胞质呈棕黄色或出现棕黄色颗粒为表达阳性。

1.4 统计分析

实验数据用x±s表示，采用SPSS 17.0软件进行统计分析，计量资料符合正态分布，多个样本均数间的比较采用单因素方差分析，两两比较采用最小显著差法，检验水准为α=0.05。

2 结果 2.1 大蒜素对小鼠体重及一般状态影响

对照组小鼠生长发育状况良好；与对照组比较，多氯联苯组小鼠体重明显下降(P < 0.05)；与多氯联苯组比较，60 mg/kg大蒜素组小鼠体重明显升高(P < 0.05)。

2.2 大蒜素对小鼠骨骼肌形态结构影响(图 1)
注：A：对照组；B：多氯联苯组；C：大蒜素(40 mg/kg)组；→：骨骼肌细胞核。 图 1 大蒜素对小鼠骨骼肌形态结构影响(HE，×200)

对照组小鼠肱三头肌和股薄肌肌纤维呈带状，横纹清晰，细胞核长卵圆形，位于肌纤维的周边(图 1A)；多氯联苯组小鼠骨骼肌纤维排列紊乱，肌细胞肿胀，横纹大多消失(图 1B)；与多氯联苯组比较，大蒜素组小鼠骨骼肌组织形态明显改善，横纹可见，但肌纤维仍稍肿胀(图 1C)。

2.3 大蒜素对小鼠骨骼肌GLUT-4表达影响

对照组小鼠骨骼肌组织中GLUT-4表达(57.25±4.32)呈强阳性，而多氯联苯组小鼠骨骼肌GLUT-4表达(16.56±1.86)呈阴性或较弱阳性，30、40和60 mg/kg大蒜素组小鼠骨骼肌GLUT-4表达[分别为(28.12±1.76)、(34.40±2.52)和(30.44±2.90)]均呈弱阳性。

2.4 大蒜素对小鼠氧化应激指标影响(表 1、2)
表 1 大蒜素对多氯联苯诱导肱三头肌细胞氧化应激指标影响(x±s，n=10)

表 2 大蒜素对多氯联苯诱导股薄肌细胞氧化应激指标影响(x±s，n=10)

与对照组比较，多氯联苯组小鼠肱三头肌和股薄肌组织中T-SOD、GSH-Px、CAT酶活力明显下降(P < 0.05)，MDA含量明显升高(P < 0.05)；与多氯联苯组比较，各大蒜素组小鼠骨骼肌中MDA含量下降(P < 0.05)，40、60 mg/kg大蒜素组小鼠骨骼肌组织中GSH-Px、CAT酶活力升高(P < 0.05)。

3 讨论

骨骼肌是胰岛素敏感的主要组织之一，参与80%胰岛素诱导的糖摄取，而胰岛素抵抗使GLUT-4蛋白表达减少，糖摄取功能减退[16-18]，从而导致机体血糖代谢紊乱，容易引发高糖血症。因此，抗氧化应激成为抑制多氯联苯造成GLUT-4表达下降的重要措施。大蒜素是从大蒜中提取的有效成分，具有较强的抗氧化能力，其抗氧化活性的部位在烯丙基位碳-氢键[19]，可以保护组织细胞免受氧化应激损伤。本研究结果显示，对照组小鼠骨骼肌纤维形态正常，而多氯联苯组小鼠骨骼肌纤维排列紊乱，肌细胞肿胀，横纹基本消失，给予大蒜素干预后的小鼠骨骼肌纤维形态明显改善；免疫组化结果显示，对照组小鼠GLUT-4阳性细胞丰富，且细胞体着色较均匀，多氯联苯组小鼠骨骼肌GLUT-4阳性细胞数明显减少，大蒜素组小鼠GLUT-4阳性细胞数减少不明显。本研究结果还显示，PCBs暴露可以导致机体抗氧化酶如SOD、CAT、GSH-Px等活性下降，造成骨骼肌组织损伤，而给予大蒜素干预后的小鼠骨骼肌组织抗氧化酶活力明显升高。提示，PCBs破坏了机体氧化和抗氧化系统的平衡，进一步诱导产生炎症因子，直接损伤骨骼肌组织细胞造成GLUT-4表达下降；大蒜素可明显改善多氯联苯造成的小鼠骨骼肌组织细胞形态结构改变，可明显升高机体抗氧化能力，对多氯联苯所致小鼠骨骼肌中GLUT-4表达下降具有一定拮抗作用。其具体机制值得进一步探讨。

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