中国公共卫生  2016, Vol. 32 Issue (8): 1108-1112   PDF    
引用本文
肖明扬, 高琳, 陈超, 薛萍, 肖莎, 阎佳宁, 张倩也, 王夕畅, 逯晓波. 核苷酸切除修复通路基因多态与慢性苯中毒关联性[J]. 中国公共卫生, 2016, 32(8): 1108-1112.
XIAO Ming-yang, GAO Lin, CHEN Chao, et al . Risk of chronic benzene poisoning and single nucleotide polymorphisms in nucleotide excision repair pathway[J]. Chinese Journal of Public Health, 2016, 32(8): 1108-1112.
核苷酸切除修复通路基因多态与慢性苯中毒关联性
肖明扬1, 高琳2, 陈超1, 薛萍1, 肖莎1, 阎佳宁1, 张倩也1, 王夕畅1, 逯晓波1     
1. 中国医科大学公共卫生学院卫生毒理教研室, 辽宁 沈阳 110001 ;
2. 沈阳市第九人民医院
收稿日期: 2015-10-12; 数字出版日期: 2016-04-27 15:02
基金项目: 国家自然科学基金（81273118，30972506）；沈阳市科技专项资金（F12-193-9-17）
作者简介: 肖明扬(1990-), 男, 山东人, 硕士在读, 研究方向:遗传毒理学。
通讯作者: 逯晓波, E-mail:xiaobo-lu@163.com
摘要: 目的 探讨核苷酸切除修复（NER）通路基因多态性、苯暴露水平和生活方式与慢性苯中毒（CBP）发病风险的关联，为筛选慢性苯中毒的易感性生物标志及其一级预防提供理论依据。 方法 知情同意后以1:2配比原则选取100名慢性苯中毒患者和200名健康对照，问卷调查后，采集2mL静脉血样，提取DNA。Taqman real time PCR检测ERCC1 rs11615、rs3212986、ERCC2 rs13181、rs1799793、rs238406基因型；引物延伸SNapshot法检测ERCC3 rs150441，ERCC4 rs4781560，XPC rs2228001、rs2279017位点SNP基因型。采用SPSS 19.0统计软件进行分析。 结果 ERCC1 rs11615 TT基因型可使慢性苯中毒发生风险增高（ORadj=3.236，95% CI=1.353～7.740），未发现ERCC1 rs3212986（χ2=0.125，P=0.939），ERCC2 rs13181（χ2=3.315，P=0.191）、rs1799793（χ2=1.796，P=0.407）、rs238406（χ2=1.182，P=0.554），ERCC3 rs150441（χ2=4.657，P=0.097），ERCC4 rs4781560（χ2=1.116，P=0.572），XPC rs2228001（χ2=1.180，P=0.554）、rs2279017（χ2=2.570，P=0.227）等基因位点与慢性苯中毒发生有关联。 结论 在苯暴露情况下，携带ERCC1 rs11615 TT基因型的个体发生慢性苯中毒的风险增高，ERCC1 rs11615多态可能成为慢性苯中毒易感人群筛选的生物学标志之一。
关键词： 慢性苯中毒(CBP)     核苷酸切除修复(NER)通路     ERCC1     单核苷酸多肽(SNP)    
Risk of chronic benzene poisoning and single nucleotide polymorphisms in nucleotide excision repair pathway
XIAO Ming-yang1, GAO Lin2, CHEN Chao1, et al     
1. 沈阳市第九人民医院 ;
2. Department of Health Toxicology, School of Public Health, China Medical University, Shenyang, Liaoning Province 110001, China
Abstract: Objective To explore associations of nucleotide excision repair (NER) pathway gene polymorphism, benzene exposure level, and lifestyle with the risk of chronic benzene poisoning (CBP) and to provide evidences for screening biomarkers and primary prevention of CBP. Methods We recruited 100 occupational CBP cases diagnosed between 1986 and 2011 at occupational disease hospitals and research institutes in Shenyang municipality and 200 gender-, age-, and benzene exposure history-matched healthy controls.A questionnaire survey and DNA extraction from 2ml venous blood sample were conducted among all the participants.We detected polymorphisms of excision repair cross-complementing(ERCC) genes (ERCC1, ERCC2, ERCC3, and ERCC4) and xeroderma pigmentosum complementation group C (XPC) gene (XPC) by real time PCR technology and we also detected single nucleotide polymorphisms (SNP) of ERCC1 (rs11615 and rs3212986), ERCC2 (rs13181, rs1799793 and rs2384060), ERCC3 rs150441, ERCC4 rs4781560, and XPC (rs2228001 and rs2279017) with SNapshot technology.We adopted SPSS 19.0 software in statistical analyses. Results An increased risk of CBP was observed among the individuals with ERCC1 rs11615 TT genotype (adjusted odds ratio=3.236, 95% confidence interval:1.353-7.740, χ2=6.964;P0.05).No significant correlation was observed between the risk of CBP and polymorphism of ERCC1 rs3212986 (χ2=0.125, P=0.939), ERCC2 rs13181(χ2=3.315, P=0.191), rs1799793(χ2=1.796, P=0.407), rs238406 (χ2=1.182, P=0.554), ERCC3 rs150441(χ2=4.657, P=0.097), ERCC4 rs4781560(χ2=1.116, P=0.572), XPC rs2228001(χ2=1.180, P=0.554), and rs2279017(χ2=2.570, P=0.227). Conclusion The study results suggest that ERCC1 rs11615 TT genotype is related to an increased risk of suffering from CBP and SNP of ERCC1 rs11615 could be considered as a valid susceptible biomarker in CBP screening among occupational populations.
Key words: chronic benzene poisoning     nucleotide excision repair pathway     ERCC1     single nucleotide poly-morphisms    

苯作为化工原料，在工农业生产加工中被广泛使用。国际癌症研究中心已确认苯为人类致癌物[1]。长期接触苯可导致慢性苯中毒(chronic benzene poisoning，CBP)[2]。苯进入机体后经过代谢形成苯醌、氢醌等物质可造成DNA损伤，细胞主要通过碱基切除修复(base excision repair，BER)、核苷酸切除修复(nucleotide excision repair，NER)、错配修复(mismatch repair，MMR)等方式来修复[3]。NER是机体最常见的DNA损伤修复机制。目前对NER与CBP发病风险的相关报道较少，且尚无定论。本研究收集100例职业性慢性苯中毒患者与200名职业性苯暴露健康人群基本信息，调查生活方式，并采集血液样本，检测NER通路中较为常见的关键基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)，探讨职业苯暴露条件下，切除修复交叉互补(excision repair cross-complementing, ERCC)基因多态位点不同基因型对CBP发病风险的影响，为CBP的一级预防和评估职业健康风险提供理论依据。

1 对象与方法 1.1 对象

按照1:2配比原则，病例组为1986—2011年来自沈阳地区当地职业病诊断机构确诊为慢性苯中毒的100例患者(1997年前以GB3230-82为诊断标准[4]，1997—2002年以GB3230-1997为诊断标准[5]，2002年后以GBZ68-2002为诊断标准[6])，对照组为同样来自于沈阳地区，与中毒患者相同性别、接触苯年龄和工龄相近而未发生中毒的人员200名，研究对象均为汉族。为保证暴露强度相同，匹配对子尽量来自于同一单位，或工种相似、苯暴露相似的工作环境。所有调查人群均符合知情同意原则。

1.2 问卷调查

问卷调查包括人口学基本特征；苯暴露强度(mg /m3)采用诊断时工作环境中苯的现时暴露水平。经常吸烟是指每天至少1只持续1年以上。饮酒是指每周平均饮酒至少7标准单位并超过6个月[7]。研究对象均在沈阳职业病医院经过严格体检，并且通过检测血清丙谷转氨酶来评估肝功能。

1.3 主要仪器与试剂

PCR仪(德国BIOMETRA公司)；CF15D低温高速离心机(日本Hitachi公司)；GR-15S低温超速离心机(美国Beckman公司)；Nanodrop核酸定量分析仪(美国Thermo公司)；ABI 7500型荧光定量PCR仪及相应分析软件(美国ABI公司)；3730遗传分析仪(美国Applied Biosystems公司)。reverse transcriptase PCR(RT-PCR)引物、TaqMan PCR混合试剂盒及SNP基因分型试剂盒(日本Takara公司)；十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS)；蛋白酶K、辅酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADP)(中国Genview公司)；琼脂糖(美国Sigma公司)；Tris-平衡酚(天津灏洋公司)；基因探针设计(美国Thermo公司)；Hidi-甲酰胺(Applied Biosystems公司)。

1.4 血样采集和DNA制备

采集每个研究对象静脉血样2 mL，装入乙二胺四乙酸抗凝管内混匀，取抗凝外周血2 mL，加8 mL红细胞裂解液，冰上放置30 min，至混合液透明，离心，弃掉上清后加红细胞裂解液4 mL，室温下充分混匀，离心，弃掉上清，加入20% SDS蛋白酶K摇匀，37 ℃摇床过夜。酚试剂法提取DNA。

1.5 基因多态性检测

采用引物延伸SNapshot检测ERCC3 rs150441、ERCC4 rs4781560、XPC rs2228001、rs2279017位点基因型。荧光和延伸产物尺寸由毛细管电泳法在3730遗传分析仪上所使用的POP-7聚合物决定的。在装载到遗传分析仪之前，将1等分处理过的SNaPshot多重延伸反应液(1 μL)与8.8 μL的Hidi-甲酰胺，0.2 μL尺寸标准液混合。用GeneMapper v4.0分析。Taqman real time PCR法检测ERCC1 rs11615、rs3212986、ERCC2 rs13181、rs1799793、rs238406位点基因型，PCR反应在一个终体积为20 μL的溶液中进行，包括：10.0 μL Premix Ex TaqTM，每个探针和引物0.4 μL，2 μL DNA(10 ng/uL)。循环条件为95 ℃ 10 min，和40次95 ℃ 5 s、60 ℃34 s循环(引物设计由美国ABI公司提供)。采用SDS软件分析SNP等位基因差异。

1.6 统计分析

采用SPSS 19.0软件进行统计分析，候选基因SNP保证符合Hardy-Weinberg平衡。组间比较采用Pearson χ2检验或Fisher确切概率法；根据性别、年龄、吸烟、饮酒、苯暴露年限分层后进行χ2检验以排除混杂因素影响。采用非条件logistic回归分析得到各基因型与慢性苯中毒发病影响的OR值和95%CI，并且根据年龄、性别、工龄、吸烟和饮酒因素得到调整后OR值和其95%CI。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 病例组和对照组基本特征比较(表 1)
表 1 病例组与对照组人群一般特征比较

病例组人群年龄17～63岁，平均37.7岁；苯暴露年限2～30年，平均12.2年；对照组年龄23～62岁，平均37.3岁；苯暴露年限1～31年，平均11.8年。2组人群性别、年龄、苯暴露年限、饮酒等因素分布差异无统计学意义(P>0.05)；吸烟在2组人群中分布差异有统计学意义(χ2=5.095，P=0.024)，除吸烟因素外病例组和对照组各因素均匹配。

2.2 NER通路基因多态性与慢性苯中毒发病风险关联性(表 2)
表 2 NER通路基因多态性对慢性苯中毒发病风险影响

ERCC1 rs11615 TT基因型在病例组和对照组间的分布频率分别为16.0%和5.0%，携带ERCC1 rs11615 TT基因型的个体患慢性苯中毒的风险高于携带CC、CT基因型的个体(OR=3.100，95%CI=1.331～7.222，χ2=6.875，P=0.009)；校正性别、年龄、暴露时间、吸烟和饮酒后，Pearson χ2检验显示2组间差异仍具有统计学意义(ORadj=3.236，95% CI=1.353～7.740，χ2=6.964，P=0.008)。

2.3 NER通路基因多态对慢性苯中毒发病危险影响分层分析

根据性别、苯暴露年限(＜12年，≥12年)、吸烟、饮酒分别进行分层分析后，发现ERCC1 rs11615 TT基因型使CBP发生风险增高现象局限于不吸烟组(OR=3.278，95%CI=1.384～7.765，χ2=7.278，P=0.007)，经过年龄、性别、苯暴露年限、饮酒调整后差异仍具有统计学意义(ORadj=3.403，95%CI=1.387～8.350，χ2=7.149，P=0.008)。在性别、苯暴露年限、饮酒分层分析中，未发现ERCC1 rs11615、rs3212986，ERCC2 rs13181、rs1799793、rs238406，ERCC3 rs150441，ERCC4 rs4781560，XPC rs2228001、rs2279017位点基因多态性与慢性苯中毒发病风险存在关联(均P > 0.05)。

3 讨论

近几年来，虽然慢性苯中毒及重大恶性苯中毒事故在国内多有报道，但在相同苯暴露环境中并不是所有接触者均发生CBP，其病情轻重程度也有所差别[8]。表明慢性苯中毒的发生除与苯暴露有关外，与个体遗传易感性可能存在一定的联系。苯作为一种人类确定致癌物可对遗传物质造成多种损伤，有研究表明苯在体外可导致人淋巴细胞存活能力下降, 细胞周期紊乱, 其机制可能与DNA损伤有关[9]，但机体可以通过修复受损的DNA而使其达到高度保真。目前已经发现的参与DNA修复的相关基因约有130个[3]，作为首要的环境应答基因，它们之间存在复杂的交互作用。针对任何一种DNA损伤，单一的修复基因不可能有效地完成修复过程，对于苯所致DNA损伤，BER、NER、MMR等途径均可参与其修复过程中。

NER主要参与苯所致DNA交联损伤及较大的DNA加合物的修复。包括至少30个活性因子，其中ERCC1基因与ERCC4/着色性干皮病互补因子F(xeroderma pigmentosum complementation group F, XPF)基因编码的蛋白质形成紧密的异二聚体(ERCC1/XPF)，可识别损伤并能切除较大DNA加合物，同时在NER中起到限速作用[10]；ERCC2基因所编码的着色性干皮病互补因子D(xeroderma pigmentosum complementation group D, XPD)既是人类转录起始因子修复转录因子II H(transcription factor IIH, TFIIH)的一部分，也是具有ATP依赖的解螺旋酶[11]；ERCC3基因编码的着色性干皮病互补因子B(xeroderma pigmentosum complementation group B, XPB)既是II类转录功能中基础转录因子2的一个亚基，也是DNA修复酶[12]；着色性干皮病互补因子C(xeroderma pigmentosum complementation group C, XPC)在NER的早期阶段起着重要作用，尤其是在识别损伤、开放复杂结构、修复蛋白质复合物结构阶段[13]。

本研究结果显示，ERCC1 rs11615 TT基因型在CBP病例组和对照组间的分布频率分别为16.0%和5.0%，差异有统计学意义，提示携带ERCC1 rs11615 TT基因型的个体发生CBP的风险较高。由于ERCC1 rs11615位点的野生型等位基因为C，因而推测该位点T等位基因突变可能影响ERCC1的转录效率及蛋白质表达水平，而异源二聚体ERCC1/XPF在NER中起着限速作用，该突变可能减弱ERCC1/XPF作为核酸内切酶对苯及其活性代谢产物所致DNA损伤的修复能力，从而导致带ERCC1 rs11615 TT基因型的个体对慢性苯中毒易感。有研究发现，由于烟草燃烧时会产生多种致癌物及重金属，但其与苯的联合作用较为复杂[14]。本研究结果表明吸烟为混杂因素，由于本研究中吸烟者相对较少，因此吸烟与ERCC1基因多态的交互作用对CBP发病风险的影响仍需做进一步研究。

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