急性肝损伤是指因肝实质的急性坏死或大部分功能失常而导致的以黄疸和肝性脑病为特征的临床综合征^[1]。通过建立急性肝损伤动物模型，探讨肝病发生机制，筛选保肝药物，具有十分重要意义。委陵菜(蔷薇科植物委陵菜属)是中国民间用于治疗免疫系统疾病和肝脏疾病的一种传统常用草药。委陵菜酸是其主要活性成分之一。本研究采用脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)、D-半乳糖胺(D-galactosamine, D-GalN)诱导小鼠急性肝损伤，观察委陵菜酸对急性肝损伤模型小鼠肝脏的保护作用及相关机制，结果报告如下。

委陵菜(南宁千金子中草药有限公司)，委陵菜酸提取与化学分析：采用乙醇回流，石油醚、氯仿和乙酸乙酯依次萃取，硅胶柱层析、洗脱，Sephadex LH-20柱色谱和高效液相色谱分离纯化得到一白色单体，经鉴定为委陵菜酸单体；LPS、D-GalN(美国Sigma公司)；水飞蓟素(上海朝晖药厂)；PCR试剂盒(日本Takara公司)；谷丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、总胆红素试剂盒(南京建成生物工程研究所)；白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白细胞介素-10(interleukin-10，IL-10)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、一氧化氮(nitric oxide，NO)试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；半胱氨酸蛋白酶-3、8、9(caspase-3、8、9)活性检测试剂盒、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)抗体、细胞色素C(cytochrome C)抗体(上海碧云天生物技术有限公司)。病理组织包埋机(上海莱卡仪器有限公司)；手持式高速匀浆机(宁波新芝生物科技股份公司)；实时荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystem公司)；电泳仪(美国Bio-Rad公司)；低温高速离心机(美国Thermo Fisher公司)；中压制备液相色谱仪(瑞士Buchi公司)；CKX-41显微镜(日本奥林巴斯公司)。

90只雄性C57BL/6小鼠，体重20~22 g，由广西医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(桂)2014-0002。将小鼠随机分为6组，即对照组、模型组、阳性对照组及委陵菜酸低、中、高剂量组；对照组、模型组灌胃给予等量生理盐水，阳性对照组灌胃给予水飞蓟素(50 mg/kg)，委陵菜酸低、中、高剂量组分别灌胃给予委陵菜酸0.75、1.50、3.00 mg/kg，每天1次，连续3 d。末次给予受试物8 h后，除对照组外，其余小鼠腹腔注射给予LPS/D-GalN，1.5 h后眼球取血1 mL，6 h后处死小鼠，解剖取出整个肝脏，立即用冰冷的生理盐水冲洗。

肝左叶标本固定于10%福尔马林溶液中，常规石蜡包埋切片，进行苏木精-伊红染色(hematoxylin and eosin staining，HE)，在显微镜下放大100倍观察结果。

AST、ALT和总胆红素含量、TNF-α，IL-6、IL-10及NO水平测定采用试剂盒法，根据试剂盒说明书操作。

采用RT-PCR法，取100 mg肝组织加入1 mL裂解液(含1%苯甲基磺酰氟，PMSF)制备肝匀浆，提取总RNA，用AB7500 Fast型荧光定量PCR仪进行实时定量PCR，以β-actin作为内参，引物序列如下：TNF-α：上游5′-ATG AGC ACA GAA AGC ATG ATC-3′，下游5′-TAC CTT AGG ACT GTC CGA ATT-3′；iNOS：上游5′-GTG AGG ATC AAA AAC TGG GG-3′，下游5′-ACC TGC AGG TTG GAC CAC-3′；β-actin：上游5′-GAT GGT GGG TAT GGG TCA GAA GGA-3′，下游5′-GCT CAT TGC CGA TAG TGA TGA CCT-3′；操作步骤按试剂盒说明书进行。

根据试剂盒说明书，从肝脏组织中提取细胞核，进行核因子NF-κB p65含量测定。

取约100 mg肝组织，剪碎，加入50 μg蛋白裂解液，冰上匀浆，采用8％的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离凝胶，转移至醋酸纤维素膜，5％脱脂奶粉封闭，分别与一抗细胞色素C和Bcl-2抗体反应，4 ℃孵育过夜，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline solution, PBS)洗涤3次，室温下用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1.5 h，PBS洗涤3次，扫描，以β-actin作为内参，进行定量分析。结果以目的条带和内参照的光密度百分比来表示。

取小鼠10 mg肝脏组织，加入100 μL裂解缓冲液后匀浆，25 000 g离心15 min，将上清液分别与caspase-3、8、9荧光底物孵育。孵育120 min后在激发波长为490 nm和发射波长为400 nm的荧光下测定吸光度(A)值，分别代表caspase-3、8、9活性。

数据以x表示，使用SPSS 11.5软件进行统计分析；不同组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用Tukey检验；P < 0.05为差异有统计学意义。

图 1

注：A：对照组，B：模型组，C、D：委陵菜酸1.50、3.00 mg/kg组。 图 1 委陵菜酸对小鼠肝组织病理结构影响(HE，×100)

病理切片显示，对照组小鼠肝小叶结构和细胞结构清晰(图 1A)；模型组小鼠肝小叶结构破坏，出现门静脉炎症、肝细胞坏死及炎性细胞浸润现象(图 1B)；委陵菜酸1.50、3.00 mg/kg组小鼠肝组织结构基本正常，门静脉炎症及炎性细胞浸润现象减少，坏死细胞数较少(图 1C、D)。

表 1

表 1 委陵菜酸对小鼠血清ALT、AST和总胆红素含量影响(x, n=15) 组别(mg/kg) AST (U/L) ALT (U/L) 总胆红素 (mg/dL) 对照组 59.3±6.1 42.7±5.6 0.23±0.03 模型组 2 183.5±138.9 a 1 833.5±125.4 a 0.65±0.06a 阳性对照组 50.00 913.2±73.6b 967.5±82.7b 0.36±0.03b 委陵菜酸 0.75 2104.2±133.5 1 629.7±118.6 0.61±0.04 1.50 1 682.5±83.5b 1 123.5±112.4b 0.43±0.04b 3.00 968.5±68.6b 991.3±70.2b 0.32±0.03b 注：与对照组比较，a P < 0.05；与模型组比较，bP < 0.05。

表 1 委陵菜酸对小鼠血清ALT、AST和总胆红素含量影响(x, n=15)

与对照组比较，模型组小鼠血清中ALT、AST和总胆红素水平明显增加，差异有统计学意义(P < 0.05)，提示肝损伤模型建立成功；与模型组比较，阳性对照组、委陵菜酸1.50、3.00 mg/kg组小鼠血清中ALT、AST和总胆红素水平明显下降，差异有统计学意义(P < 0.05)。

表 2

表 2 委陵菜酸对小鼠血清炎症因子水平影响(x, n=15) 组别(mg/kg) IL-6(pg/mL) TNF-α (pg/mL) NO (μmol/L) IL-10(pg/mL) 对照组 65.35±4.84 57.9±4.9 15.66±2.47 93.7±6.7 模型组 1 296.52±158.8 a 656.8±64.7 a 205.28±16.79 a 1 678.8±123.8 a 阳性对照组 50.00 783.23±93.2b 313.8±39.1b 156.80±9.41b 3 285.6±197.6b 委陵菜酸 0.75 1 296.52±158.8 616.3±55.9 196.45±12.78 1 868.5±194.6 1.50 783.54±93.3b 443.1±42.3b 168.52±11.81b 2 898.3±152.8b 3.00 697.35±77.9 b 226.5±35.9b 133.69±9.79b 3 641.7±208.8b 注：与对照组比较，a P < 0.05；与模型组比较，bP < 0.05。

表 2 委陵菜酸对小鼠血清炎症因子水平影响(x, n=15)

与对照组比较，模型组小鼠血清中IL-6、TNF-α、NO水平明显升高，IL-10水平明显降低，差异有统计学意义(P < 0.05)；与模型组比较，阳性对照组、委陵菜酸1.50、3.00 mg/kg组小鼠血清中IL-6、TNF-α、NO水平明显降低，而IL-10水平明显升高，差异有统计学意义(P < 0.05)。

表 3

表 3 委陵菜酸对小鼠肝脏中iNOS、TNF-α mRNA表达影响(x, n=15) 组别(mg/kg) iNOS TNF-α 对照组 0.069±0.01 0.067±0.01 模型组 0.746±0.05a 0.420±0.03a 阳性对照组 50.00 0.233±0.03b 0.252±0.02b 委陵菜酸 0.75 0.691±0.04 0.385±0.03 1.50 0.177±0.03b 0.373±0.02 3.00 0.109±0.02b 0.189±0.02b 注：与对照组比较，a P < 0.05；与模型组比较，b P < 0.05。

表 3 委陵菜酸对小鼠肝脏中iNOS、TNF-α mRNA表达影响(x, n=15)

与对照组比较，模型组小鼠肝脏中iNOS mRNA和TNF-α mRNA表达明显增加(P < 0.05)；与模型组比较，阳性对照组、委陵菜酸1.50、3.00 mg/kg组小鼠肝脏中iNOS mRNA表达明显降低(P < 0.05)，委陵菜酸3.00 mg/kg组小鼠肝脏中TNF-α mRNA表达明显降低(P < 0.05)。

结果显示，对照组、模型组、阳性对照组、委陵菜酸0.75、1.50、3.00 mg/kg组小鼠肝脏中NF-κB p65蛋白含量分别为(36.8±3.47)、(228.9±14.2)、(112.3±8.6)、(212.5±12.5)、(198.2±15.8)、(151.2±6.5)pg/mg；与对照组比较，模型组小鼠肝脏中NF-κB p65蛋白表达明显升高(P < 0.05)；与模型组比较，阳性对照组、委陵菜酸各剂量组小鼠肝脏中NF-κB p65蛋白表达明显降低，呈剂量效应关系。

表 4

表 4 委陵菜酸对小鼠肝组织中凋亡因子水平影响(x, n=15) 组别(mg/kg) Bcl-2 cytochrom C caspases-3 caspases-8 caspases-9 对照组 0.42±0.02 0.22±0.02 100.0±3.9 100.0±4.4 100.0±3.2 模型组 0.18±0.03 a 0.62±0.03 a 275.3±14.7 a 308.6±15.8 a 327.9±17.3 a 阳性对照组 50.00 0.36±0.02b 0.46±0.03b 133.9±9.1b 173.8±6.9b 166.8±7.6b 委陵菜酸 0.75 0.21±0.02 0.59±0.03 266.8±9.9 293.7±13.7 312.5±14.5 1.50 0.23±0.01 0.35±0.01b 186.8±7.2b 218.2±10.3b 238.5±10.8b 3.00 0.35±0.02b 0.28±0.02b 156.3±5.9b 203.9±8.7b 174.6±8.8b 注：与对照组比较，a P < 0.05；与模型组比较，bP < 0.05。

表 4 委陵菜酸对小鼠肝组织中凋亡因子水平影响(x, n=15)

与对照组比较，模型组小鼠肝组织中细胞色素C、caspase-3、8、9表达明显升高(P < 0.05)，Bcl-2表达明显降低(P < 0.05)；与模型组比较，阳性对照组、委陵菜酸1.50、3.00 mg/kg组小鼠肝组织中细胞色素C、caspase-3、8、9表达明显降低(P < 0.05)，阳性对照组、委陵菜酸3.00 mg/kg组小鼠肝组织中Bcl-2表达明显升高(P < 0.05)。

近年来，人们发现D-GalN能增强LPS的敏感性和肝损伤的特异性，两者联合腹腔注射诱导的急性肝衰竭模型与临床急性肝衰竭机制相似，LPS/D-GalN联合致肝损伤是目前国际上通用的急性肝损伤动物模型制备方法^[2]。本研究采用LPS联合D-GalN腹腔注射构建急性肝损伤模型，结果显示，模型组小鼠血清AST、ALT和总胆红素含量明显升高，肝脏病理切片显示静脉炎症、细胞坏死以及炎症细胞浸润等病理改变，提示造模成功；与模型组比较，委陵菜酸干预组小鼠血清中ALT、AST和总胆红素水平下降。提示，委陵菜酸对LPS/D-GalN诱导的急性肝损伤具有一定保护作用。

有研究显示，TNF-α诱导的肝细胞凋亡在急性肝损伤动物模型的肝损伤早期发挥作用^[3]。LPS/D-GalN诱导炎症细胞释放多种促炎细胞因子，继而产生抗炎性细胞因子，致使体内促炎细胞因子与内源性抗炎介质失衡。本研究结果表明，随着委陵菜酸剂量增加，小鼠血清中TNF-α和IL-6水平降低、IL-10水平增加，提示委陵菜酸可能通过调节促炎和抗炎细胞因子平衡而发挥保肝作用。NO在NOS作用下由L-精氨酸转化而来，NO通过对乌苷酸环磷酶中铁原子作用，使血管平滑肌舒张；NOS是生成NO的关键环节，一方面它在原生酶(cNOS)作用下参与生理性调节血管张力过程, 另一方面它激活诱生酶(iNOS)，介导血管内皮细胞的损伤，产生大量NO^[4]。NO参与多种生理和病理过程，并可能发挥毒性效应。本研究结果表明，委陵菜酸可明显抑制小鼠体内NO含量及肝脏中iNOS酶活性。提示，委陵菜酸保肝作用可能与其抑制NO含量升高有关。

NF-κB是一种广泛存在于体内多种细胞内的核转录因子，在调节机体的免疫和炎症反应及凋亡调控等方面发挥重要作用。活化的NF-κB转位到核内可促进相关基因表达，参与调控的基因有细胞因子、生长因子、炎症介质等，而这些物质在肝纤维化的发生中具有重要作用^[5]。研究表明，NF-κB直接调节TNF-α、IL-6和iNOS等炎症细胞因子，可通过抑制NF-κB活化减少过度炎症反应^[6]。半胱氨酸蛋白酶(caspase)家族是直接导致凋亡细胞解体的蛋白酶系统，处于细胞凋亡级联调控的下游。目前普遍认为caspase家族成员是近些年来发现的在细胞凋亡过程中起关键作用的酶，caspase-3被证实是细胞凋亡的效应分子，在凋亡的终末执行阶段被激活，可水解底物的天冬氨酸，故被称为凋亡的执行者^[7]。经典的细胞凋亡2条途径分别为外源性途径和内源性途径，外源性途径主要由caspase-8激活触发，而内源性途径由caspase-9激活触发^[8]。研究表明，线粒体释放细胞色素C至细胞浆，与凋亡细胞蛋白酶激活因子(Apaf-1)结合，在dATP条件下，Apaf1和caspase-9酶原结合使caspase-9酶原活化，继而激活下游的caspase-2、3、6、7、8、10，从而启动级联细胞凋亡^[9]。本研究结果表明，委陵菜酸可明显降低小鼠肝脏中NF-κB p65、细胞色素c、caspase-3、8、9含量，增加Bcl-2的表达。提示，委陵菜酸可能通过减少NF-κB的活化而抑制炎性细胞因子的过度释放发挥保肝作用。