蚀斑实验作为准确评估病毒感染性的金标准^[1]，耗时长，建立一种快速准确的活病毒定量检测方法成为需要。Nogva等^[2]人首先提出一种联合qPCR与DNA染料叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide，EMA)的方法，用以区分死活大肠杆菌O157:H7。随后Andrea等^[3]人应用一种新的DNA染料叠氮溴化丙锭(propidium monoazide，PMA)联合qPCR定量活菌，发现PMA-qPCR可更高选择性地扩增活菌的DNA，故被广泛应用于不同种类的活菌定量检测^[4-8]。近几年国外学者也将PMA-qPCR应用于定量检测感染性病毒，如甲肝病毒(hepatitis A virus，HAV)^[9]、T4噬菌体^[10]、柯萨奇病毒^[11]等。国内鲜有报道，仅韦玉梅^[12]率先将PMA-qPCR方法用于轮状病毒。本研究主要就PMA-qPCR作用机理、灭活病毒方案展开讨论，并比较不同方法检测病毒感染性的差异。

叠氮溴化丙锭是一种具有高亲和力的光敏反应DNA结合染料，不能通过活细胞膜^[13]，只能选择性的修饰死细胞“暴露”的DNA(胞膜已破损的细胞)。这一特性使得它可以和实时荧光定量PCR方法联合使用，选择性扩增活细胞DNA，不扩增死细胞DNA，因此PMA-qPCR技术被广泛应用于检测及定量活细菌。同样，PMA只能选择性进入失活病毒的衣壳(及包膜)，与病毒的基因组共价结合，抑制其扩增，结合qPCR方法简介达到检测及定量活病毒的目的。PMA-qPCR检测病毒感染性的效率受到多方因素的影响，如活病毒的预处理、致死方法、PMA的用量浓度、PMA的孵育及曝光时间等。

PMA作为一种高亲和力的DNA染料，其本身仅有微弱荧光，当与核酸结合后具有高度荧光效应。光解作用下，染料上的光敏叠氮基转变为高反应性的氮烯自由基，氮烯基极容易与结合部位核酸的碳氢化合物形成氮碳共价键，从而形成牢固的DNA修饰或者RNA修饰。PMA可以抑制被修饰DNA(或者RNA)的聚合酶链反应，从而将衣壳完整的活病毒与衣壳缺损的非感染性病毒区分开来。

实验中不同方法灭活病毒的原理不同，造成病毒的损伤不一，使得PMA-qPCR检测活病毒的准确性不一样。

高温灭活是实验室最常用的病毒灭活方式，研究发现噬菌体T4^[10]、HAV^[9]、肠道病毒^[11]分别在110 ℃，15 min、99 ℃，5 min及72 ℃，6 min灭活条件下，允许PMA完全进入，达到区分死活病毒的目的。人体常温37 ℃/2周预处理脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒及诺沃克病毒等肠道病毒后，PMA-qPCR也能区分感染性病毒与灭活病毒。而以水体常温19 ℃处理4周，则无法区分。Graiver等^[14]人发现，热致死对病毒衣壳的破坏程度甚至大于蛋白酶解。但各类病毒的衣壳蛋白对温度的敏感性存在差异，针对不同病毒，往往需要不同的灭活温度才能使得PMA渗入与核酸结合。通常情况下，100 ℃预处理活病毒10 min，可避免PMA-qPCR在检测感染性病毒时出现假阳性。对于包膜病毒，灭活温度对PMA渗入程度的作用或许有较大差异，有待于进一步的研究。

次氯酸盐是水源消毒灭菌的常用消毒剂，已知可用4～6%次氯酸钠生成100 mg/L的游离氯预处理活病毒。Sánchez等^[9]则发现用次氯酸盐灭活病毒，可导致PMA-qPCR检测结果的假阳性，其原因可能在于核酸的二级结构会影响PMA与之结合，例如5′UTR。游离氯破坏基因组中的5′UTR，阻碍PMA对核酸的修饰工作，使得灭活病毒的核酸能有效扩增，导致假阳性的发生^[15-16]。

在HAV的研究中发现，以500 MPa预处理活病毒15 min，起始温度45 ℃，病毒的RNA并未充分暴露^[9]，可能的原因在于高压处理仅轻微改变了病毒的衣壳蛋白。有学者提出，非感染性病毒衣壳蛋白对蛋白酶更为敏感^[11]，对于高压灭活处理的病毒，或许可以使用蛋白酶K预处理样本，促进PMA渗透病毒衣壳，修饰核酸。

目前较少使用，因为紫外线杀菌的原理在于破坏微生物DNA或RNA的分子结构，不适用于PMA-qPCR。

常规PMA预处理的方法为将PMA加入病毒悬液中，至最终浓度为50 μmol，于室温条件下在黑暗中孵育5 min，经常轻微摇晃使之混合均匀，然后置于冰上，卤素灯曝光5 min(也可采用蓝色LED曝光系统)，光源距离微量离心管20 cm，并经常摇晃。有研究表明100 μmol的PMA也能达到预期效果^[9]，当浓度升至200 μmol时，与100 μmol的实验结果无明显差异^[11]。其他研究则发现，100 μmol的PMA预处理后存在非特异性结合^[17]，而当PMA升高至200 μmol可消除PCR过程中的非特异性结合^[18-19]。目前的研究中尚缺乏对PMA预处理最佳条件的系统探讨，孵育时间多在5~10 min，曝光时间根据具体情况可延长至15 min。PMA可选择性渗透灭活病毒的衣壳，与其核酸形成共价结合，从而抑制扩增。与此相似，RNase可选择性进入失活RNA病毒衣壳，水解RNA，使得仅活病毒RNA进行逆转录并扩增，达到检测病毒感染性的目的。RNase联合RT-qPCR已证实可有效检测活病毒^[20]。Sánchez等^[9]在检测甲肝病毒感染性时发现，PMA-RT-qPCR检测效率优于RNase-RT-qPCR。5′UTR作为PMA结合的关键部位，或能促进PMA的绑定，抑制RNase的活性。当然，具有类似作用的部位或者基团不一定仅此一处。另有学者提出，非感染性病毒衣壳蛋白对蛋白酶更为敏感^{[11, 21]}。后续研究或可探讨将蛋白酶与PMA联合应用，以期PMA能更加充分地渗入非感染性病毒的衣壳。

实时荧光定量PCR(qPCR)常用于检测各种样本中的病毒污染，被广泛应用于水源及食品安全等卫生检测工作中^[22-24]。单纯qPCR能快捷简便地检测出病毒污染，但却不能区分病毒的感染性，不能准确提示对于人类的健康风险^[25]。因为单纯qPCR荧光信号既可来源于感染性病毒，又可来源于非感染性病毒，不能准确评估检测样本中病原体的致病性。水体被病毒污染后，病毒核酸的存留时间长于其感染能力的维持时间^[26]，即病毒已丧失了感染性，但其核酸依然能与引物结合，产生PCR反应，使qPCR不能准确反映病原体的致病性。

相对于单纯qPCR，噬斑或者TCID₅₀等利用细胞培养进行病毒定量的实验更能评估病毒的感染性。但细胞培养存在的首要缺点是耗时长，通常需要数天到数周^{[10, 27]}，细胞培养结果的滞后性很大程度上不能满足科研及临床检验工作的需要。同时，研究表明，很多危害公共健康的病毒很难培养甚至是尚不能培养或者不引起明显的细胞病变^[27]，如绿猴肾细胞作为研究肠道病毒和急性胃肠炎病毒的通用宿主细胞^[28]，甲肝病毒及轮状病毒均不能引起BGM细胞病变，诺瓦克病毒则不能存活于现已建立的细胞培养系统中^[5]。同时，感染性病毒的培养受条件的影响，如宿主细胞的暴露时间、培养液、细胞代数及有害代谢物质的出现^[29]。这些因素会进一步增加细胞培养定量检测活病毒的局限性。

在活病毒定量的研究中，还有一种联合细胞培养与PCR的方法(ICC-PCR)，其检测对象为感染性病毒的mRNA。感染性病毒侵入宿主细胞，遗传物质转录成mRNA，并翻译表达，ICC-PCR借此即可定量活病毒。通常过程为病毒感染宿主细胞发生细胞病变，然后在细胞溶解产物中加入不含RNase的脱氧核糖核酸酶(DNase)，去除DNA，提纯mRNA，再进行逆转录并实时荧光定量PCR^[30]。在采用ICC-PCR定量腺病毒的研究中^[31]，对于进入宿主细胞复制但不引起细胞病变的病毒，ICC-PCR可以检测出来，这在一定程度上弥补了细胞培养的缺陷。在某些特定条件下，ICC-PCR可以仅检测到感染性病毒，有待进一步研究^[11]。ICC-PCR仅适用于可培养病毒，尚不能检测诺瓦克病毒。另ICC-PCR在时间上快于细胞培养，但仍需至少2天。

PMA-qPCR作为近几年建立的活病毒定量的新方法，具有高效快捷、费用低等优点。但也存在不足，如有研究显示，对于某些条件下灭活的病毒，细胞培养检测阴性时，PMA-qPCR检测可呈阳性^[10]。病毒的感染依赖于包膜、衣壳和核酸的完整性，灭活条件的差异直接导致包膜和衣壳损伤程度的差异，包膜和衣壳的轻微损伤可使其丧失感染性，但并不足以使得PMA完全渗透包膜和衣壳，从而导致PMA-qPCR检测活病毒出现假阳性。例如衣壳蛋白上与病毒吸附宿主相关的受体受损，病毒丧失感染性，同时衣壳相对完整。对于大多数包膜病毒而言，其感染能力还依赖于包膜的完整性^[32]。PMA渗入包膜病毒与其核酸结合，需要包膜与衣壳的双重允许作用，同时因为病毒包膜来源于宿主细胞，故对包膜病毒的PMA预处理或许相对复杂，有待后续更深入的研究。衣壳和包膜的损伤程度不同，PMA-qPCR显示的结果也会不同，即PMA-qPCR可提示衣壳和包膜损伤。因此，PMA-qPCR或可成为一种快速、简便地分析工具，用于评价消毒液对病毒灭活的效率，有助于制订灭活病毒的合理方案，并可借此研究引起衣壳和包膜损伤而致病毒失活的因素。PMA-qPCR基于实时荧光定量PCR技术，理论上适用于所有病毒的定量检测，亟待解决的问题是PMA预处理的方法。针对不同病毒，如何确定最适的PMA预处理条件，使得PMA能充分渗透非感染性病毒的衣壳(及包膜)，形成牢固的DNA修饰，是目前亟待解决的难题。

相比PMA，叠氮溴化乙锭(EMA)用于活病毒定量方面的研究较少。有学者比较了EMA-RT-qPCR和噬斑法等对流感病毒定量检测的差异，发现前者存在假阳性，因此EMA-qPCR不适用于流感病毒感染性的定量检测^[14]。

PMA-qPCR被广泛应用于具有感染性的细菌^[33-35]、真菌^[36]、甚至贾滴鞭毛虫^[37]及隐孢子虫的定量检测^[38]，现正被更广泛的用于活病毒检测的研究中。目前的研究结果表明，对于不同病毒，PMA预处理的具体实验条件不同；对于同一病毒，不同灭活方案所致病毒衣壳和包膜的损伤程度不同，对PMA渗透的允许程度也存在差异，因此需要探索最适条件的PMA预处理方案。相比细胞培养的耗时长以及单纯qPCR无法准确反应病毒感染性方面的缺陷，PMA-qPCR在活病毒定量检测方面具有明显优势。这一特性或可使PMA-qPCR在病毒学研究中的应用范围更加广泛，如活病毒的检测、衣壳和包膜损伤的评估、消毒剂的功效、消杀病毒方案的筛选等。