病毒性腹泻病是全球性婴幼儿的常见病和多发病，尤其是重症腹泻患儿如不及时治疗可危及生命，严重威胁着儿童的身体健康和生命安全^[1]中国自1998年，开展了婴幼儿病毒性腹泻的监测工作，河北省卢龙县为婴幼儿病毒性腹泻监测点，1998年本监测点中在国内首次报道轮状病毒G3型流行株的出现^[2]，并发现少见的G5型轮状病毒^[3]。本研究于2010—2014年对卢龙县县医院所有＜5岁住院腹泻儿童进行全年性监测，收集腹泻样本进行轮状病毒(human rotavirus，HRV)、杯状病毒(human calicivirus，HuCV)、腺病毒(adenovirus，AdeV)、星状病毒(astrovirus，AstV)的检测并将HRV 和HuCV进行分型。现将结果报告如下。

以2010—2014年在河北省卢龙县医院所有住院治疗的＜5岁腹泻儿童作为研究对象，患儿住院时进行流行病学调查并知情同意，调查表内容包括患儿的姓名、性别、发病时间、入院时间、临床症状、病程等，同时采集患儿腹泻标本冻存。定期上送国家和省疾病预防控制中心进行检测。

DEIAs^TM Rotavirus试剂盒(英国Dakocytomation公司)，TaqDNA聚合酶 、AMV逆转录酶(美国Promegacorporation公司)，RNA酶抑制剂、DNAMakerDL2000(宝生物工程(大连)有限公司)，Trizol购自Nolecular Researcyh Center Inc.dNTPs(上海赛百盛公司)，PCR仪(美国ABI公司)。

HRV血清采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测方法，HRV、HuCV、AstV、Adev基因分型采用反转录酶-聚合酶链锁反应(reverse-transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)^[4].用TRIZOL提取病毒核酸，先逆转录合成病毒cDNA，再巢式PCR进行分型。

采用Excel 2010软件对数据进行整理，应用SPSS 17.0软件，采用 χ²检验对不同年度4种病毒感染率的分析，检验水准a=0.05。

卢龙县位于河北省东北部，属于半山区丘陵地带的农业县，总人口41万，＜5岁儿童占总人口6.2%。全县只有一所县医院，大多数重症腹泻均由该院收治。腹泻病毒感染的患儿，最小月龄为 1个月，最大月龄为 57个月，多数病例为9~12 月龄，发病主要集中每年的11月到次年的1、2、3、4月份，主要症状为呕吐和腹泻，重症者可引起脱水，病程多为一周左右。

2010—2014年卢龙县医院住院＜5岁腹泻儿童18 80份腹泻样本，经检测HRV、HuCV、 AdeV和AstV 4种病毒，阳性样本1 356份，阳性率为72.1 %，有逐年增加的趋势(χ²=39.1 P＜.001)。

表 1

表 1 2010—2014年 河北省卢龙县婴幼儿腹泻病原检测结果 年份 样本数 HRV HuCV AdeV AstV 合计 % 阳性 % 阳性 % 阳性 % 阳性 % 2010 414 182 43.9 52 12.6 6 1.4 6 1.4 246 59.7 2011 347 159 45.8 61 17.6 11 3.2 9 2.6 240 69.2 2012 394 165 41.9 113 28.7 24 6.1 7 1.8 309 78.4 2013 371 172 46.4 70 18.9 42 11.3 14 3.8 298 80.3 2014 354 168 47.5 48 13.6 36 10.2 11 3.1 263 74.3 合计 1 880 846 45.0 344 18.3 119 6.3 47 2.5 1 356 72.1 χ趋势2值 1.88 53.4 41.2 8.2 39.1 P值 0.15 ＜0.001 ＜0.001 0.06 ＜0.001

表 1 2010—2014年 河北省卢龙县婴幼儿腹泻病原检测结果

HRV病例最多是12月份为254例，占30%，其次是1月份191例，占22.6%，2月份93例，占10.9%，3月份69例，占8.2%，4月份33例，占3.9%，5月份32例，占3.8%，6月份14例，占1.7%，7月份4例，占0.5%，8月份1例，占0.1%，9月份4例，0.5%，10月份14例，1.7%，11月份137例，16.2%。HuCV病例最多为 1月份61例，占17.7%、3月份48例，占14.0%和2月份43例，占12.5%，其次是11月份37例，占10.8%和12月份41例，占11.9%，4月份30例，占8.7%，5月份9例，占2.6%，6月份13例，占3.8%，7月份24例，占7.0%，8月份9例，占2.6%，9月份13例，占3.8%，10月份16例，占4.7%。腺病毒病例最多月份为11月份15例，占12.6%和4月份14例，占11.7%，其次是12月份13例，占10.9%、1月份12例，占10.1%和2月份12例，占10.1%，3月份为7例，占5.9%，5月份为9例，占7.6%，6月份为11例，占9.2%，7月份为10例，占8.4%，8月份为2例，占1.7%，9月份为3例，占2.5%，10月份为11例，占9.2%。Astv的病例最多是3月份10例，占21.3%和2月份8例，占17.0%，其次是5月份6例，占12.8%和1月份5例，占10.6%，4月份为3例，占6.4%，6月份为3例，占6.4%，7月份为1例，占2.1%，8月份为1例，占2.1%，9月份为3例，占6.4%，10月份为1例，占2.1%，11月份为2例，占4.3%，12月份为4例，占8.5%。

HRV感染的病例以 12~月龄组最多占38.1%，其次9~月龄组和6~月龄组分别占24.2%和13.8%。HuCV感染病例分布与HRV相似，以12~月龄组最多占32.6%，其次9~月龄组和6~月龄组分别占20.3%和16.0%。AdeV感染病例以9~月龄组最多占21.8%，其次是6~月龄组和12~月龄组分别占21.0%，Astv感染病例以12~月龄组最多占38.2%，其次是9~月龄组占17.0%，6~月龄组和18~月龄组分别占14.9%。

表 3

表 3 2010—2014年河北省卢龙县婴幼儿腹泻病原在患儿月龄分布 月龄 (月) HRV HucV AdeV AstV 例数 % 例数 % 例数 % 例数 % 0~ 10 1.2 5 1.5 4 3.4 1 2.1 3~ 54 6.4 35 10.2 15 12.6 1 2.1 6~ 117 13.8 55 16.0 25 21.0 7 14.9 9~ 205 24.2 70 20.3 26 21.8 8 17.0 12~ 322 38.1 112 32.6 25 21.0 18 38.2 18~ 74 8.7 37 10.8 10 8.4 7 14.9 24~ 45 5.3 19 5.5 13 10.9 4 8.5 36~ 11 1.3 8 2.3 1 0.8 1 2.1 48~ 8 0.9 3 0.9 0 0.0 0 0.0 合计 846 344 119 47

表 3 2010—2014年河北省卢龙县婴幼儿腹泻病原在患儿月龄分布

对分离的894株HRV(其中有48人同时感染2种不同的血清型，因此比感染总例多了48个)进行了G血清型分型鉴定其结果：G9平均检出率占57.6%，2010年检出率最低为25.9%，2014年检出率最高为86.5%，呈逐年增多的趋势，已成为目前的流行毒株。G3平均的检出率为25.1%，2010年检出率最高为55.8是当年的流行毒株，但以后逐年减少，被G9所取代。其次的检出率分别是G1(9.1%)、G2(7.5%)、G4(0.6%)、G8(0.2%)。

从846例HRV阳性样本中选取了783株HRV(因有63株未能分型，所以比总数少63例)进行P基因分型，基因P^[8]型平均检出率为83.7%，2010年检出率最低为73.6%，2014年检出率最高为93.4%，呈逐年增加的趋势是目前流行的毒株，其次是P^[4]基因型检出率平均为11.2%，再次之是P^[6]、P^[9]、P^[10]检出率分别为4.1%、0.3%、0.6%。

表 4

表 4 2010—2014年河北省卢龙县HRV的P基因分型结果 年份 P[8] % P[4] % P[6] % P[9] % P[10] % 合计 2010 109 73.6 6 4.1 27 18.2 1 0.7 5 3.4 148 2011 110 85.3 16 12.4 1 0.8 1 0.8 1 0.8 129 2012 149 91.9 13 8.1 0 0.0 0 0.0 0 0.0 162 2013 131 74.0 44 24.9 2 1.1 0 0.0 0 0.0 177 2014 156 93.4 9 5.3 2 1.2 0 0.0 0 0.0 167 合计 655 83.7 88 11.2 32 4.1 2 0.3 6 0.8 783

表 4 2010—2014年河北省卢龙县HRV的P基因分型结果

344株HuCV经分型鉴定 其中诺如病毒248株，包括GⅠ21株，GⅡ227株，札如病毒37株，诺如病毒GⅡ为优势株，占80.5%。

表 5

表 5 2010—2014年河北省卢龙县HuCV的分型结果 年份 诺如 GⅠ % 诺如 GⅡ % 札如 % 未分型 % 合计 2010 3 5.8 38 73.1 11 21.2 0 0.0 52 2011 2 3.3 55 90.2 4 6.6 0 0.0 61 2012 5 4.4 101 89.4 7 6.2 0 0.0 113 2013 10 14.3 50 71.4 10 14.3 0 0.0 70 2014 1 2.1 33 68.8 5 10.4 9 18.8 48 合计 21 6.1 277 80.5 37 10.8 9 2.6 344

表 5 2010—2014年河北省卢龙县HuCV的分型结果

关于婴幼儿腹泻的病原 该病的病原较为复杂，但较为常见是病毒和细菌。近年来，由于人们饮食卫生水平和卫生习惯的不断提升，加之特异性治疗的方法，使细菌性儿童腹泻的发病率大幅度下降，导致儿童腹泻病的流行特征发生了演变，早在80年代前中国儿童腹泻病的发病高峰在每年的7、8、9月份，而近年来该病的发病高峰推移到每年的12月和1月的严冬季节，本文结果也证实这一点。而公共卫生措施的干预使病毒性儿童腹泻的发病率没有受到影响，其常见病原有 HRV、HuCV、Astv和 AdeV等。本文结果表明，HRV、HuCV、Astv和 AdeV 4种病毒，总平均阳性率为 72.1%，而不同年份四种病毒的检出率在逐年地增加。说明病毒性病原占婴幼儿腹泻病原的重要地位。而HRV的检出率最高，其次是HuCV、AdeV和Astv.进一步说明HRV是婴幼儿病毒性腹泻的重要病原^[5-6]。HRV 血清型是病毒外壳蛋白VP4和VP7抗原性的不同区分的，分别为P(VP4，protease sensitive)型和G(VP7，glycoprotein)型。VP4由第4基因编码，以棘突的形式分布于病毒外壳上，在多数动物毒株中有血凝的作用，并限制病毒在组织培养中和动物模型中生长。VP4对蛋白酶敏感，在胰酶作用下解离为VP5和VP8，可增加病毒的感染能力。P型目前分为13个不同的血清型，其中8个感染人(1A、1B、2A、3、3B、4、5、8)。由于VP4获得特异性抗体比较困难通常根据VP4基因核苷酸序列的不同采用RT-PCR区分VP4的基因型，目前以确定了20个P基因型其中9个感染人.HRV感染中常见的P型为P1A^[8]、P1B^[4]、P2A^[6]和P3^[9]。VP7约占病毒蛋白的30%，可由基因节段9、8、7编码。至今可鉴定14个G血清型其中10个可感染人(1、2、3、4、5、8、10、12)。以前G1、G2、G3、G4与流行病学意义，因此目前该疫苗的使用的HRV病毒抗原为G1~4。这四种G血清型在中国和其他国家曾是流行株，尤其是G1血清型，在1998—1999年流行季节中中国8个城市以G1型为主(83.4%)，G2型(3.2%)，G3型(12%)^[7]。而1999年卢龙县婴幼儿HRV腹泻的监测结果以G3血清型为主(61.7%)^[2]。2008—2009年该监测点的结果仍 以HRV G3为主要流行株，而本次研究结果HRVG3血清型仅占25.1%，从2010年以后该血清型在逐年减少。而HRVG9血清型在1998年以前该血清型在中国的检出率非常低，1998—2004年中国4个地区仅检出G9血清型34株，卢龙县仅2003年检出1株^[8]，而本次结果从2011年HRVG9型检出率大幅度上升并成为流行株，其他地区也有相应的报道^[9]这一结果应引起有关研究人员高度重视。在研制HRV腹泻的疫苗时应加入HRVG9型的抗原成分。新流行株的出现给防治HRV儿童腹泻提出了严重的挑战，有关部门和人员应积极面对调整防治方案和措施，做好该病防治工作。HuCV通过病毒基因组RNA多聚酶和壳体蛋白区域核苷酸以及氨基酸序列的差异可分为诺如和札如病毒，诺如病毒被分为GⅠ和GⅡ两个遗传组，每组有包括14和7个不同型，扎如病毒分为SGⅠ、SGⅡ、SGⅢ3个遗传组。本文仅将HuCV分成诺如病毒属和札如病毒属。有将诺如病毒属鉴定到组，结果表明婴幼儿HuCV腹泻优势株主要是GⅡ遗传组与以前的报道相似^[10]。AdeV 和Astv的分型 有待进一步研究。从本次研究结果看，HRV发病的高峰月是12月份，其次是1月份，>94.5%的病例分布在每年的11月份到次年的5月份，与以前报道结果相近^[11]。HuCV发病的高峰季节为 1月、2月和3月，其次是11月和12月份，与HRV不同的是HuCV在气温较高的5、6月份仍有发病。而且有报道在气温高的季节HuCV曾可引起急性胃肠炎的暴发流行^[12]。腺病毒的发病高峰月份为11月和4月，其次是12月份。Astv的发病高峰月份是3月和2月份，其次是5月和1月份。以上各种病毒性的腹泻发病高峰月份与2008—2009年报告的结果个有所异^[11]，其原因可能与每年度的气温和湿度的变化有关。本文研究结果表明，4种病毒的感染发病月龄组均以12~月龄组、9~ 月龄组和6~月龄组所占比例最高 其次是18~月龄组 这些年龄组是病毒性腹泻防治的重点人群，虽然其他月龄组如0~月龄组、48~月龄组发病人数少，但也不可忽视，这些结果为采取疫苗预防提供了免疫人群的重点对象和初免月龄的重要依据。综上所述，病毒性腹泻在儿童腹泻病中占有重要位置，而病毒性腹泻中HRV是重要病原，HRVG9从2009年感染的病毒株开始增加^[12]，本文结果显示从2010—2014年该病毒株成为流行株，这一结果为防治HRV腹泻提供了非常重要的科学依据。HRV感染发病季节随不同的年份气温的变化不同而有所差^[13]，HRV腹泻具有严格的季节性，感染发病对象主要是12~月龄组，而HuCV、AdeV 和Astv 3种病毒全年各月份均可发生病例感染，感染发病的对象主要是12~月龄组9~月龄组和6~龄组，由于这3种病毒观察的病例较少，有待进一步研究。