中国公共卫生  2016, Vol. 32 Issue (7): 928-930   PDF    
引用本文
罗明, 梁冰, 陈文章, 樊玲玲, 汤磊. 树豆酮酸A对HepG2细胞体外糖代谢影响[J]. 中国公共卫生, 2016, 32(7): 928-930.
LUO Ming, LIANG Bing, CHEN Wen-zhang, et al . Effect of cajanonic acid A on glucose metabolism in HepG2 cells in vitro[J]. Chinese Journal of Public Health, 2016, 32(7): 928-930.
树豆酮酸A对HepG2细胞体外糖代谢影响
罗明1, 梁冰1, 陈文章2, 樊玲玲2, 汤磊2     
1. 贵州医科大学药理学教研室, 贵州 贵阳 550025 ;
2. 贵州医科大学药学院
收稿日期: 2016-03-14; 数字出版日期: 2016-06-15.
基金项目: 国家自然科学基金（81360470），贵州省教育厅青年项目（黔教合KY字[2014]300号）
作者简介: 罗明(1987-),男.湖南岳阳人,硕士在读,研究方向:新药筛选药理学。
通讯作者: 梁冰,E-mail:bliang163@163.com
摘要: 目的 探讨树豆酮酸A对HepG2细胞糖代谢影响及机制。 方法 体外培养HepG2细胞，实验设10-3、10-4、10-5、10-6 mol/L树豆酮酸A组，作用24 h，采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法检测HepG2细胞葡萄糖消耗量，ELISA法检测糖代谢相关酶己糖激酶（HK）和丙酮酸脱氢酶（PDH）活性。 结果 10-3、10-4、10-5 mol/L树豆酮酸A组HepG2细胞葡萄糖消耗量分别为（8.650±0.319）、（8.231±0.182）、（8.136±0.402）mmol/L，明显高于对照组[（6.521±0.056）mmol/L]，差异有统计学意义（P <0.05）；10-3、10-4 mol/L树豆酮酸A 组HepG2细胞内HK含量分别为（882.91±30.72）、（718.25±20.67）pg/mL，明显高于对照组[（616.65±17.24）pg/mL]；10-3 mol/L 树豆酮酸A组 HepG2细胞内PDH含量为（1 526.69±66.74）pg/mL，明显高于对照组[（1 204.73±55.72）pg/mL]，差异有统计学意义（P <0.05）。 结论 树豆酮酸A在体外可促进HepG2细胞对葡萄糖的摄取，具有降糖活性，其作用机制可能与增强糖代谢相关酶己糖激酶和丙酮酸脱氢酶活性有关。
关键词： 树豆酮酸A     HepG2细胞     糖代谢     己糖激酶(HK)     丙酮酸脱氢酶(PDH)    
Effect of cajanonic acid A on glucose metabolism in HepG2 cells in vitro
LUO Ming1, LIANG Bing1, CHEN Wen-zhang2, et al     
Department of Pharmacology, Guizhou Medical University, Gui-yang, Guizhou Province, 550025, China
Abstract: Objective To explore the effect of cajanonic acid A on glucose metabolism of HepG2 cells and its mechanism. Methods HepG2 cells were cultured in vitro and administered with cajanonic acid A at different doses of 10-3, 10-4, 10-5 and 10-6 mol/L.The glucose consumption of HepG2 cells was detected with glucose oxidase-peroxidase enzyme method and the activity of sugar metabolism related enzymes hexokinase(HK)and pyruvate dehydrogenase(PDH)were detected with enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)24 hours after the administration. Results For the HepG2 cells treated with 10-3, 10-4 and 10-5 mol/L cajanonic acid A, the glucose consumption were 8.650±0.319, 8.231±0.182, and 8.136±0.402 mmol/L, respectively, and were all significantly higher than that of the control group (6.521±0.056 mmol/L)(P <0.05).The HK contents were 882.91±30.72 and 718.25±20.67 pg/mL in the HepG2 cells treated with 10-3 and 10-4mol/L cajanonic acid A and were significantly higher than that of the control group (616.65±17.24 pg/mL).The PDH content was 1 526.69±66.74 pg/mL in the HepG2 cells treated with 10-3 mol/L cajanonic acid A and significantly higher than that of the control group (1 204.73±55.72 pg/mL)(P <0.05). Conclusion Cajanonic acid A can promote glucose uptake of HepG2 cells in vitro and has hypoglycemic effect;the effects may be associated with the enhanced the activity of glucose metabolism enzyme-hexokinase and pyruvate dehydrogenase.
Key words: cajanonic acid A     HepG2 cell     glucose metabolism     hexokinase     pyruvatedehydrogenase    

糖尿病是一种由于机体胰岛素分泌绝对或相对不足而引起的以高血糖为特征的代谢性疾病。糖尿病不仅导致营养物质代谢紊乱，还可引起急慢性并发症，严重危害健康[1-2]。中药树豆又名木豆，药用价值广泛，树豆酮酸A是树豆的主要活性成份[3]。研究显示，树豆酮酸A是一个潜在的可用于治疗糖尿病的化合物[4]。本研究以体外培养的HepG2细胞为研究对象，观察树豆酮酸A的体外降糖作用及机制，结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器

HepG2肝癌细胞株(中国科学院上海细胞库)；DMEM培养基(美国Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；胰蛋白酶(北京索莱宝生物工程有限公司)；胰岛素(上海翊圣生物科技有限公司，批号101151)；二甲双胍、树豆酮酸A(2-羟基-4-甲氧基-5-异戊烯基-6-苯酰甲酸苯甲酸)，由贵州医科大学药学院提供；己糖激酶(hexokinase，HK)、丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase，PDH)、葡萄糖测定试剂盒(南京建成生物技术有限公司，批号分别为201511、201511、20150804147)。CK40-F200型光学倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)；EXL800型酶标仪(美国BLO-TEK公司)；CO2培养箱(美国Thermo Forma公司)。

1.2 HepG2细胞培养

HepG2细胞用含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM高糖培养基在37 ℃、5%CO2培养箱中培养，2 d换1次液；待细胞贴壁长满后，胰蛋白酶消化，传代，取对数生长期细胞用于实验。

1.3 分组与处理

取对数生长期HepG2细胞按4×105个/mL接种于96孔板，待细胞贴壁后，换液，加入无血清培养基，饥饿12 h使细胞同步化，吸去培养基；将树豆酮酸A用二甲基亚砜(DMSO)作助溶剂，以DMEM为溶剂，溶于高糖培养基中，实验设无细胞纯培养基组、对照组、树豆酮酸A 10-3、10-4、10-5、10-6 mol/L组(DMSO含量＜0.1%)、二甲双胍和胰岛素组(以DMEM为溶剂)，浓度分别为10-4、10-10 mol/L。

1.4 指标与方法 1.4.1 HepG2细胞葡萄糖消耗量检测[5-6]

加入受试物HepG2细胞于培养箱中孵育24 h，孵育结束后，吸取2 μL上清液，采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法测定葡萄糖含量；以无细胞纯培养基中葡萄糖含量减去实验各组细胞培养液中葡萄糖含量，即为细胞所消耗的葡萄糖含量(GC)。

1.4.2 HepG2细胞活力检测

采用噻唑蓝法(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT法)，待测完葡萄糖含量后，立即每孔加入10 μL噻唑蓝孵育4 h；孵育结束，吸去上清液，每孔加入100 μL dimethly sulfoxide(DMSO)充分溶解结晶物，轻微摇匀15 min，在酶标仪上570 nm波长处测定吸光度(A)值。此MTT实验用来校正细胞数目对葡萄糖消耗量的影响。以GC/A比值表示单位细胞对葡萄糖的消耗量；以GC/A比值除以无细胞纯培养基中葡萄糖含量，即为各组细胞葡萄糖摄取率。

1.4.3 HepG2细胞中HK和PDH活性检测[7-9]

加入受试物HepG2细胞于培养箱中孵育24 h，孵育结束后，胰酶消化细胞，用磷酸盐缓冲液[phosphate buffered saline (PBS)，pH 7.2~7.4]稀释细胞悬液，计数，使细胞浓度达到1×106个/mL；通过反复冻融，使细胞破坏并释放出细胞内成分；2500 r/min离心20 min，收集上清；采用酶联免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测细胞内HK和PDH活性，具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.5 统计分析

数据以x±s表示；采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析；组间两两比较，采用最小显著差法；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果 2.1 树豆酮酸A对HepG2细胞葡萄糖消耗量影响(表 1)

细胞活力检测结果显示，与对照组比较，除 10-3 mol/L树豆酮酸A组HepG2细胞活力降低外，其余各组HepG2细胞活力无明显变化。与对照组比较，胰岛素组、二甲双胍组HepG2细胞葡萄糖消耗量与葡萄糖摄取率均升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；与对照组比较，10-3、10-4、10-5 mol/L树豆酮酸A组HepG2细胞单位细胞葡萄糖消耗量(GC/A)增加，差异有统计学意义(P＜0.05)；与对照组比较，10-3、10-4 mol/L树豆酮酸A组HepG2细胞葡萄糖摄取率升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。

表 1 树豆酮酸A对HepG2细胞葡萄糖消耗量影响(x±s，n=4)

2.2 树豆酮酸A对HepG2细胞HK和PDH活性影响(表 2)

与对照组比较，10-3、10-4 mol/L树豆酮酸A组HepG2细胞中HK活性增加，10-3 mol/L树豆酮酸A组HepG2细胞中PDH活性增加，差异均具有统计学意义(均P＜0.05)。

表 2 树豆酮酸A对HepG2细胞HK和PDH活性影响(pg/mL，x±s，n=4)

3 讨 论

肝脏是调节血糖浓度的主要器官，肝细胞是糖代谢作用的靶细胞之一。HepG2细胞源于人肝胚胎瘤细胞，是分化较好的人肝癌细胞，仍有肝细胞形态和功能。因HepG2细胞可表达胰岛素受体和胰岛素样生长因子的代谢反应，是较为常用的糖尿病药物筛选模型[10]。本研究结果表明树豆酮酸A可促进HepG2细胞对葡萄糖的摄取，使培养基中的HepG2细胞的葡萄糖消耗量增加，葡萄糖摄取率升高。本研究结果还显示，与对照组比较，10-3 mol/L树豆酮酸A 组HepG2细胞活力降低、单位细胞葡萄糖消耗量(GC/A值)和葡萄糖摄取率均略高于二甲双胍组。提示，10-3 mol/L剂量树豆酮酸A降糖效果最为明显，但其对HepG2细胞增殖是否具有一定抑制作用还有待进一步研究加以证实。

葡萄糖的无氧酵解和有氧氧化是机体内糖代谢的主要途径，己糖激酶和丙酮酸脱氢酶是参与葡萄糖代谢的关键酶。其中，己糖激酶是糖酵解的关键酶，可在三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)的参与下将葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖。而丙酮酸脱氢酶是葡萄糖有氧氧化途径的关键酶，可催化丙酮酸生成乙酰辅酶A(acetyl coenzyme A，CoA)[11]。当肝细胞内己糖激酶和丙酮酸脱氢酶活性下降时，会导致糖原合成与葡萄糖分解减少，最终引起糖代谢紊乱，演变为2型糖尿病。本研究结果显示，10-3 mol/L树豆酮酸A可增加HepG2细胞内己糖激酶和丙酮酸脱氢酶的活性，使糖代谢作用增强。提示，树豆酮酸A的降糖作用可能与增强糖的无氧酵解和有氧氧化有关，这可能是树豆酮酸A促进HepG2细胞对葡萄糖摄取的一个重要机制之一。

参考文献
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