中国公共卫生  2016, Vol. 32 Issue (7): 907-912   PDF    
引用本文
杨鹏飞, 燕清丽, 甄维, 张敏会, 刘纯成, 时玉军, 李军鹰, 姚海波, 何南江. 人感染新型H10N8禽流感病毒基因特征检测分析[J]. 中国公共卫生, 2016, 32(7): 907-912.
YANG Peng-fei, YAN Qing-li, ZHEN Wei, et al . Genetic characteristics of novel avian influenza A H10N8 virus isolated in human[J]. Chinese Journal of Public Health, 2016, 32(7): 907-912.
人感染新型H10N8禽流感病毒基因特征检测分析
杨鹏飞1, 燕清丽1, 甄维2, 张敏会1, 刘纯成1, 时玉军1, 李军鹰1, 姚海波1, 何南江1     
1. 淮安市疾病预防控制中心检验科, 江苏 223001 ;
2. 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所
收稿日期: 2015-10-28; 数字出版日期: 2016-06-17.
基金项目: 淮安市预防医学科研基金（hayf201516）
作者简介: 杨鹏飞(1983-),男,山西阳泉人,助理研究员,硕士,主要从事分子病毒学研究。
通讯作者: 何江南,E-mail:hahnj110@163.com
摘要: 目的 了解新型H10N8禽流感病毒基因进化特征，分析血凝素（HA）及神经氨酸酶（NA）关键氨基酸位点变异。 方法 2013年12月江西省发现首例人感染新型H10N8禽流感病毒病例，分析其病毒基因核苷酸及氨基酸变异。 结果 新型H10N8禽流感病毒[（A/Jiangxi-Donghu/346/2013（H10N8），JX346）]HA基因与A/duck/Hunan/S11205/2012（H10N3）同源性为97.0%，NA基因与A/mallard/Korea/1041/2010（H10N8）的同源性为98.8%，6个内部基因与江西分离的H9N2病毒同源性≥99.0%；JX346的HA的氨基酸裂解位点为PELIQGR↓G，存在5个糖基化位点，在其130环处存在突变为A135T、K137R和S138A；NA存在7个糖基化位点，其抗原决定簇有3个氨基酸位点变异，S199A、A331S和K431N；HA有2个正向选择位点（119N，261I），NA有1个正向选择位点（263V）。 结果 新型H10N8禽流感病毒可能由H10N3、H10N8及H9N2禽流感病毒重排产生的一种低致病性禽流感病毒，其关键氨基酸位点的突变可能是人易感染的原因。
关键词： 新型H10N8禽流感病毒     基因特征     分子进化     选择压力    
Genetic characteristics of novel avian influenza A H10N8 virus isolated in human
YANG Peng-fei1, YAN Qing-li1, ZHEN Wei2, et al     
Department of Clinical Laboratory, Huai'an Municipal Center for Disease Control and Prevention, Huai'an, Jiangsu Province 223001, China
Abstract: Objective To examine evolutionary characteristics of genome of novel avian influenza A H10N8 virus and to analyze the variation of the key amino acid sites of hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA). Methods First human infection case of novel avian influenza AH10N8 virus was diagnosed in Jiangxi province, China in December 2013.The variations in gene nucleotide and amino acid sequence of the novel avian influenza AH10N8 virus strain isolated were analyzed. Results The HA and NA gene sequence of the novel avian influenza A H10N8 virus strain (A/Jiangxi-Donghu/346/2013[H10N8], shortly named JX346) showed high identity with A/duck/Hunan/S11205/2012 (H10N3)(97.0%) and A/mallard/Korea/1041/2010 (H10N8)(98.8%), respectively, and the six internal genes showed a more than 99.0% homology with avian influenza A H9N2 virus strain isolated from Jiangxi province.The amino acid sequence of HA at the hemagglutinin cleavage site of the JX346 was PELIQGR↓G and the HA with five glycosylation sites had substitutions (S199A, A331S, K431N)in the 130 loop.Meanwhile, there were seven glycosylation sites in the NA and three substitutions (S199A, A331S, K431N) in its antigenic epitopes.Selection pressure analysis indicated that 3 positively selected sites in major surface protein of the JX346 strain. Conclusion The novel avian influenza A H10N8 virus strain may be the reassortants of avian influenza A H10N3, H10N8 and H9N2N virus.The substitutions in the key sites of novel avian influenza A H10N8 virus may result in human infection.
Key words: novel avian influenza A H10N8 virus     genetic characteristics     molecular evolution     selection pressure    

流感病毒属正粘病毒科，为有包膜单股负链分节段的RNA病毒。编码血凝素(hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(neuraminidase，NA)的基因决定了流感病毒的型别，共18种HA和11种NA。除H17、H18、N10和N11外，其余均在野生水禽中检测到[1]。禽流感病毒感染人的型别有H5型(H5N1及H5N6)、H7型(H7N1、H7N2、H7N3、H7N7及H7N9)及H9型(H9N2)[2-3]。2013年12月江西省发现了全球首例人感染新型H10N8禽流感病毒病例[4]。本研究分析新型H10N8禽流感病毒基因序列、主要抗原位点及遗传进化等病原生物学特性，现将结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 H10N8株基因序列

所有的H10Nx和HyN8禽流感病毒毒株序列均来源于全球禽流感基因共享数据库(Global Initiative on Sharing Avian Influenza Data，GISAID)。检索GISAID，查询中国各省存在的H10Nx和HyN8型的禽流感病毒序列。

1.2 序列分析

利用Lasergene软件包中的Meg Align软件对病毒的HA和NA的核苷酸序列进行比对及同源性分析。利用Clustalx 1.83软件进行序列比对及格式转化。利用PHYLIP V3.6软件包进行系统发生分析，以最大似然法(maximum likehood，ML)分别构建HA及NA系统进化树。

1.3 糖基化位点预测

根据推导的氨基酸序列分析HA及NA的生物学特征并利用Net NGlyc 1.0软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)进行糖基化位点的预测。

1.4 选择压力分析

利用MEGA 5.0 软件中的Muscle程序对HA及NA基因的核苷酸进行多重比对，并且删除所有序列的终止密码子。HA及NA基因的选择压力分别采用固定效应似然法(fixed effect likelihood，FEL)、内枝固定效应似然法(internal branches fixed-effect likelihood，IEFL)、单似然祖先计数(single likelihood ancestor counting，SLAC)3种方法通过在线分析软件(http://www.datamonkey.org/)进行检测。根据nonsynony-mous-to-synonymous substitution(dN/dS)值来判断选择的方向。当dN/dS﹥l且模型具明显差异时，说明为正向选择；反之，当0﹤dN/dS﹤1时，则说明是净化选择[5]。

2 结 果 2.1 H10Nx和HyN8型禽流感病毒分布(图 1)

通过检索GISAID，查询中国目前存在的H10Nx型和HyN8型禽流感病毒所有型别。中国存在的HyN8型禽流感病毒主要以H3N8为主，在中国多个省份均有单一或共同分布，而H10Nx型禽流感病毒在中国的分布则主要聚集在南方地区。同时，发生人感染H10N8禽流感病毒的江西存在多种型别的禽流感病毒，其邻近省份湖南、湖北也存在不同型别的H10型及N8型禽流感病毒。

图 1 中国目前存在的H10Nx型和HyN8型禽流感病毒分布

2.2 系统进化分析(图 2、3)

经Meg Align软件对新型H10N8型禽流感病毒JX346与目前全球的H10型禽流感病毒进行同源性分析，JX346株与H10型禽流感病毒株的同源性为80.4%~97.0%，与A/longtail duck/Maryland/295/2005(H10N8)株的同源性最低，为80.4%。在中国流行的H10型禽流感病毒中，JX346株与湖北株A/duck/Hubei/137/1985(H10N4)的同源性最低，＜86.0%，而与A/chicken/Hubei/119/1983(H10N5)的同源性为88.3%；与香港株A/duck/HongKong/562/1979(H10N9)、A/northern shoveler/HongKong/MPE/2984/2008(H10N9)同源性分别为88.0%、92.1%；与江苏株、贵州株、广东株的同源性较高，即A/chicken/Jiangsu/RD5/2013(H10N9)为94.1%、A/goose/Guizhou/829/2012(H10N7)为94.5%、A/duck/Guangdong/E1/2012(H10N8)为95.4%；与湖南株A/environment/Dongting Lake/Hunan/3-9/2007(H10N8)的同源性为93.0%，A/duck/Hunan/S11205/2012(H10N3)的同源性最高为97.0%。从图 2的进化树可以看出JX346株与中国湖南地区流行株A/duck/Hunan/S11205/2012(H10N3)聚集在一起，并与韩国的流行株H10N1、H10N6以及中国的H10N5、H10N7、H10N9、H10N8等同属欧亚进化枝。同源性分析显示，JX346株与N8型禽流感病毒株的同源性为76.8%~98.8%，分析发现与A/herring gull/Mongolia/454/2008(H13N8)同源性最低，仅为76.8%。与中国现阶段存在的N8型禽流感病毒相比，与A/duck/Guizhou/1073/2007(H3N8)、A/duck/Eastern China/50/2002(H6N8)及A/wild duck/Jiangxi/19615/2009(H7N8)的同源性均＜78.5%，与广西株A/duck/Guangxi/GXd-6/2010(H6N8)的同源性为96.5%；与H10N8型禽流感病毒株相比，发现JX346株与中国洞庭湖水体及外环境中分离到的H10N8毒株A/water/Dongting Lake/Hunan/3-9/2007(H10N8)及A/environment/Dongting Lake/Hunan/3-9/2007(H10N8)同源性均＜79.0%，与美国流行株A/longtail duck/Maryland/295/2005(H10N8)、A/shorebird/Delaware Bay/379/2008(H10N8)、A/ruddy turnstone/New Jersey/1148668/2004(H10N8)同源性均＞92.5%，与韩国绿头鸭中分离到的病毒株A/mallard/Korea/1041/2010(H10N8)的同源性最高，为98.8%。通过进化树分析发现JX346株与韩国株A/mallard/Korea/1041/2010(H10N8)聚集在一起，与广西株A/duck/Guangxi/GXd-6/2010(H6N8)及美国流行株共同分在一进化簇中，同属于北美进化谱系。同时发现，JX346与中国存在的其他禽流感病毒如：A/duck/Guizhou/1073/2007(H3N8)、A/duck/Eastern China/50/2002(H6N8)、A/wild duck/Jiangxi/19615/2009(H7N8)、A/water/Dongting Lake/Hunan/3-9/2007(H10N8)及A/environment/Dongting Lake/Hunan/3-9/2007(H10N8)分别属于不同的进化谱系。

注：以H7N9病毒为外群，利用ML法基于HA序列构建的H10N8病毒的进化树，构建的进化树只显示﹥50的自展值，a为新型H10N8禽流感病毒。 图 2 利用ML法基于HA序列构建H10N8病毒进化树

注：以H7N9病毒为外群，利用ML法基于NA序列构建的H10N8病毒的进化树，构建的进化树只显示>50的自展值，a为新型H10N8禽流感病毒。 图 3 利用ML法基于NA序列构建H10N8病毒进化树

2.3 内部基因比对(表 1)

在National Center for Biotechnology Information(NCBI)中比对JX346株的内部基因PB1、PB2、PA、MP、NP、NS，发现JX346株的内部基因与江西分离的禽流感病毒的核苷酸同源性最高，表中列出了JX346株与江西分离的禽流感病毒毒株核苷酸最高的3个毒株(均≥99.0%)。相对于每个基因片段而言，核苷酸同源性最高的3个毒株中均有H9N2型，同时也有混合型病毒(如H10、H9、N2、N8)。从分离宿主(来源)来看主要为鸡、鸭以及活禽交易市场的外环境。

表 1 A/Jiangxi-Donghu/346/2013(H10N8)内部基因片段的比对结果

2.4 信号肽及裂解位点

推导的氨基酸序列中JX346的HA的信号肽为MYK IVV IIA LLG AVK G，与A/duck/Hunan/S11205/2012(H10N3)、A/environment/Dongting Lake/Hunan/3-9/2007(H10N8)、A/northern shoveler/ HongKong/ MPE/ 2984/ 2008 (H10N9)的序列一致，但与广东流行的H10N8禽流感病毒相比，在位点-5处由R突变为G；与A/duck/HongKong/562/1979(H10N9)相比发生变异的位点为R(-2)K、V(-8)A、A(-12)V、V(-13)I；与A/chicken/Hubei/119/1983(H10N5)相比，变异位点为R(-2)K、A(-12)V、V(-13)I；与A/duck/Hubei/137/1985(H10N4)相比为R(-2)K、V(-13)I；与A/goose/Guizhou/829/2012(H10N7)相比，在位点(-4)、(-8)均由T突变为A。同时发现，JX346 HA的裂解位点为PELIQGR↓G，与核苷酸同源性最高的毒株A/duck/Hunan/S11205/2012(H10N3)相比，发现变异的位点为M327I；与国内流行的H10N8病毒株相比，均有2个位点的变异如I326K、M327I或V327I；与国外流行的H10N8病毒株相比，则只在326位点或327位点存在变异，如I326K或M327I。

2.5 推导氨基酸的抗原决定簇特点(表 2)

通过对推导的氨基酸序列分析发现，在HA的受体结合位点98、153、155、183、190、194、195处，JX346的氨基酸残基与国内流行的H10N8禽流感病毒(如A/environment/Dongting Lake/Hunan/3-9/2007(H10N8)、A/ duck/ Guangdong/ E1/ 2012 (H10N8))、国外流行的H10N8禽流感病毒(如A/ruddy turnstone/New Jersey/1148668/2004(H10N8)、A/mallard/Korea/1203/2010(H10N8))一致，分别为Y、W、V、H、E、L、Y，均未发生变异。在190螺旋(190-198)处，未发生变异；在220环(224-229)处，其氨基酸残基分别为N、G、Q、S、G、R，与国内外流行的H10N8禽流感病毒一致，未发生变异；在130环(134-138)处，JX346的氨基酸残基分别为G、T、T、R、A，与A/duck/Guangdong/E1/2012(H10N8)、A/mallard/Korea/1203/2010(H10N8)、A/ruddy turnstone/New Jersey/1148668/2004(H10N8)均有1个位点的差异，分别为137 K、137 K、138 S。推导的氨基酸序列中JX346的N末端胞浆尾区为MNPNQK，与甲型流感病毒其他型别一样。JX346的NA存在7个抗原决定簇，其抗原决定簇的位点与其他H10N8病毒株的氨基酸序列一致，但在位点199，331，431有所不同。在位点199和331处，JX346株与A/environment/DTLake/Hunan/3-9/2007(H10N8)、 A/mallard/Korea/1041/2010(H10N8)、A/ruddy turnstone/NJ/1148668/2004A/shorebird/DB/379/2008(H10N8)一致分别为A和S，而与A/water/DT Lake/Hunan/3-9/2007(H10N8)和 A/longtail duck/Maryland/295/2005(H10N8)相比则发生变异，为S191A和A331S。同时发现在位点431处JX346株由K突变为N。

表 2 H10N8病毒株的NA抗原位点

2.6 糖基化位点

JX346的HA的潜在糖基化位点与H10型禽流感病毒的一致，在位点22、38、242、411、483均为N-X-T型，其中X分别为G、A、I、W、N。JX346的神经氨酸酶的潜在糖基化位点为7个，其中2个位点为N-X-S型：44(N-E-S)、402(N-W-S)，5个位点为N-X-T型：48(N-E-T)、56(N-E-T)、86(N-N-T)、146(N-G-T)及294(N-W-T)。其中44位糖基化位点与自他H10N8病毒株的氨基酸组成不一致。

2.7 选择方向检测(表 3)

利用在线分析软件对目前全球存在的H10N8病毒株进行选择压力测试，选择3种不同的方法对其HA和NA分析至少有2种方法检测到HA和NA分别有2个(119N，261I)和1个(263V)氨基酸位点处于正向选择趋势。通过对上述3个方法比较发现SLAC法提示H10N8病毒进化方式趋向于中性选择，而FEL和IFEL法则提示H10N8病毒进化方式趋向于负向选择即净化选择。

表 3 H10N8病毒的进化选择方向统计

3 讨 论

H10N8禽流感病毒最早于1965年在意大利的鹌鹑中分离到[6]。2007年中国首次从洞庭湖外环境水样中分离到该病毒，随后在广东一活禽交易市场中也分离到[7-8]。尽管H10N8禽流感病毒发现比较早，但一直没有发现其感染人的事件，直到2013年12月，中国证实全球首例人感染H10N8禽流感病毒的病例在江西发现。通过病原学分析发现分离出的病株JX346与之前发现的H10N8禽流感病毒不同，其HA基因可能来源于欧亚谱系的H10N8禽流感病毒，NA来源于北美谱系，6个内部基因来源于江西的禽流感病毒H9N2，为新的病毒重排株。这种重排现象与中国的家禽饲养模式以及活禽交易模式有关[9-10]。有研究证实此病毒的HA及NA基因来源模式相似，HA和NA均是通过野鸟或鸭子体内发生重排并进一步在鸡中进行基因重排形成新的重排株，后者与H9N2禽流感病毒再次发生重排形成新的H10N8禽流感病毒[4]。

禽流感病毒裂解位点处碱性氨基酸的数目与病毒的传播及致病性有关。通常裂解位点处包含1个碱性氨基酸的病毒为低致病性的病毒；裂解位点处含有多个碱性氨基酸为高致病性禽流感病毒如H5N1病毒[11]。本研究中发现JX346株的裂解位点处只含有1个R，提示JX346株为低致病性禽流感病毒。NA茎部氨基酸的缺失可以增强病毒在家禽体内的致病力，更加利于病毒的感染和传播[12]。H5N1禽流感病毒茎部氨基酸的缺失导致其在哺乳动物宿主体内的致病力增强，同时发现H7N9禽流感病毒的NA茎部也存在类似的现象[13-14]。本研究发现，JX346株的NA茎部氨基酸的没有发生缺失，可推测尽管JX346株感染人，但其致病力相对于H5N1及H7N9较弱。

病毒所受的选择压力可以反映宿主机体免疫力情况及病毒进化模式[15]。禽流感病毒和其他RNA病毒一样，由于RNA聚合酶缺乏校正功能，在感染的宿主体内形成准种[13]。同时，由于宿主免疫压力使得HA、NA的氨基酸位点易受正向选择，从而导致病毒发生免疫逃逸。本研究中发现JX346株的HA119、261位点及NA263位点处存在氨基酸多态性并且为正向选择位点，提示新的重组病毒株通过改变HA及NA的部分氨基酸以持续感染宿主。尽管病毒中存在阳性选择位点，但通过本研究发现病毒的大部分氨基酸位点趋于净化选择，提示新产生的病毒JX346跨域种属屏障(从家禽到人)后，已经消除有害的位点突变，产生功能较为保守的蛋白来适应机体免疫。

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