中国狂犬病发病死亡的病例数较高，2005—2015年已超20 000例，广东等地为高发区^[1]。狂犬病毒主要由犬传播给人，其他动物也能携带狂犬病毒，如蝙蝠、鼠等^[2]。杜福等^[3]曾对广东地区129只鼠进行狂犬病毒检测，阳性率为1.6%；广西、吉林、海南、广东等地区蝙蝠体内亦检测出狂犬病毒^{[2, 4-5]}。提示鼠和蝙蝠存在传播狂犬病的潜在危险。通过调查野生动物携带狂犬病毒的状况，将有助于评估这些动物作为狂犬病传染源的风险。为此，本研究于2013—2015年在广东省广州市部分地区采集鼠及蝙蝠样本并对其进行狂犬病毒检测，现将结果报告如下。

2013—2015年在广州市部分公园、医院、农贸市场、学校等地采用捕鼠笼，以炒花生米或油条等作为诱饵诱捕鼠。采集蝙蝠的地点主要为房屋瓦片下和公园棕榈树，布网进行捕捉。鼠和蝙蝠经鉴定种属后，用乙醚麻醉处死，无菌开颅，取出部分脑组织，置于RNAlater溶液(罗氏上海有限公司)中，-80℃冰箱保存，待检。

取出部分脑组织，用1 mL平衡盐溶液洗去RANlater溶液，然后匀浆、制成混悬液，8 500 g离心5 min后，取200μL上清液进行病毒RNA提取。根据说明书，用Roche high pure viral RNA kit(罗氏上海有限公司)提取病毒RNA，并用Roche Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(罗氏上海有限公司)将提取的病毒RNA逆转录成cDNA。采用巢式聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)进行狂犬病毒的特异性扩增。依据参考文献^[6]，在深圳华大基因有限公司合成巢式PCR引物。该巢式PCR的特异性扩增的目标片段长度为255 bp。阳性对照为狂犬病毒疫苗(购于吉林省五星动物保健厂)，阴性对照为去离子水。将PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

将可疑阳性的鼠和蝙蝠脑组织样本用平衡盐溶液制成混悬液，8 500 g离心5 min后，吸出上清液，0.22μm过滤器过滤，取500μL过滤液感染单层Vero细胞，孵育1 h后，补加含5%胎牛血清维持培养基，37℃孵箱继续培养7 d。阳性对照为狂犬病毒液，阴性对照为不含血清的细胞培养液(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)。观察染毒后的Vero细胞是否发现病变，如变圆、皱缩、聚集、脱落等现象。将染毒后的细胞置于-80℃冰箱，反复冻融3次后，盲传至少3代。取上清液，用RT-PCR检测狂犬病毒。

本次调查共捕获159只家鼠和66只蝙蝠(57只犬蝠、9只伏翼蝠)，外观健康，未见明显的损伤或疾病症状。

表 1

表 1 2013—2015年广州市部分地区捕捉家鼠及蝙蝠基本情况 动物种类 数量(只) 捕捉地点 栖息环境 鼠 褐家鼠(Rattus norvegicus) 159 医院、学校、农贸市场 屋檐、垃圾桶、草丛、下水道 蝙蝠 犬蝠(Cynopterus sphinx) 57 公园、学校 棕榈树 伏翼蝠(Pipistrelle) 9 医院 房顶瓦片下

表 1 2013—2015年广州市部分地区捕捉家鼠及蝙蝠基本情况

待测样本中未检测出狂犬病毒核酸特异条带。

图 1

注：M：标准分子量(bp)；1~14:待测样本；15:阳性对照；16:阴性对照 图 1 1.5%琼脂糖凝胶电泳

镜下可见阳性对照染毒细胞后，Vero细胞出现聚集、脱落等细胞病变现象，并能用RT-PCR在细胞冻融液中检测出狂犬病毒核酸。待测样本染毒细胞后，生长良好，未见明显的细胞病变现象，用RT-PCR未能检测出狂犬病毒核酸。

图 2

图 2 Vero细胞培养和病变

褐家鼠为广州地区优势家鼠，本次调查在广州地区收集了159份褐家鼠脑组织样本，未检测出狂犬病毒。赵云蛟等^[7]在河南牛狂犬病疫区的野鼠脑内分离出1株狂犬病毒全序，该病毒株属于狂犬病毒基因I型。有学者运用RT-PCR对广西省和浙江省的野鼠进行狂犬病毒的检测，发现阳性率分别为3.1%(2/65)和1.8%(1/57)^{[2, 8]}。而首次从家鼠中分离获得狂犬病毒见于1992年，侯世宽^[9]对狂犬病疫区38只家鼠用夹心酶联免疫吸附测定法检测鼠脑中的狂犬病病毒抗原，发现3份阳性样本，并用接种小鼠的方法成功分离出狂犬病毒。也有学者检测97份狂犬病疫区家鼠血清，狂犬病抗体阳性率达20.8%^[10]。国内目前缺乏对家鼠携带狂犬病毒的系统和大规模的调查研究，文献报道主要在野鼠身上检测出狂犬病毒，分离鼠源性病毒全序株少，再加上检测方法存在一定的假阳性率，尚不明确鼠在狂犬病毒的自然史的作用。人类因为鼠而获狂犬病的病例罕见，国内报道的2例病例均在狂犬病疫区^[5]，是否因鼠类传播也未能完全确定。本次调查也未能在159份褐家鼠脑组织中检测和分离出狂犬病毒，提示褐家鼠可能携带和传播狂犬病毒的风险较小。

中国人类因蝙蝠咬伤感染狂犬病毒最先报道于2002年^[11]，吉林省电视台广播的1名工作人员被蝙蝠咬伤耳朵，出现狂犬病临床表现后，第10 d死亡。在欧美等国家，吸血蝙蝠对狂犬病毒的传播起重要作用，国内检出狂犬病毒的蝙蝠种属主要为食虫蝙蝠、果蝠和白腹管鼻蝠等。有学者在广西、吉林、海南、广东等地区分别采集588、261、183、207只蝙蝠，狂犬病毒的检出率为0.9%～3.3%^{[2, 4-5]}。有研究在健康蝙蝠身上检测出狂犬病毒^[12]，提示蝙蝠可能适应了狂犬病毒，而这种带毒的健康蝙蝠能否将病毒传播给其他种属的动物以及带毒的时间仍不明确。本次调查选取人类活动频繁的地点，如学校、公园、医院等，捕捉到的蝙蝠外观健康，RT-PCR和细胞培养分离的检测结果均为阴性。可能有如下原因：(1)已有报道中蝙蝠携带狂犬病毒率较低，而本次研究捕捉的蝙蝠数量较少；(2)蝙蝠种属对狂犬病毒的敏感性不一致，犬蝠和伏翼蝠可能不携带狂犬病毒，文献也未见对于此2个种属蝙蝠携带狂犬病毒的相关报道。

据文献报道，国内>95%的人狂犬病病例由病犬捉咬伤引起^[1]，犬作为狂犬病主要的传播源，与以下因素相关：(1)犬体型较大，携带病毒载量高，能通过唾液分泌大量病毒；(2)与人类接触密切，犬感染狂犬病毒发病后，表现躁狂，易侵袭人类；(3)犬类带毒时间长，有报道指出犬类可感染狂犬病毒，但不发病的情况，可持续带毒和排毒，咬伤人类后仍可使人类发病致死^[2]；(4)犬类携带病毒率高。本次调查采集的褐家鼠、犬蝠、伏翼蝠体型较小，未发现携带狂犬病毒，因此，目前数据表明广州地区这些动物作为人类狂犬病传染源的风险不大。但是，由于本研究样本量小，确切的结论尚有待大范围和大样本的流行病学调查。