中国公共卫生  2016, Vol. 32 Issue (6): 828-831   PDF    
引用本文
张正君, 杨兴林, 黄海. 贵阳市2013—2015年手足口病患儿EV71病毒VP1、VP4基因特征分析[J]. 中国公共卫生, 2016, 32(6): 828-831.
ZHANG Zheng-jun, YANG Xing-lin, HUANG Hai. Sequence analysis of VPl and VP4 genes of enterovirus 71 strains isolated from children with hand-foot-mouth disease in Guiyang city, 2013-2015[J]. Chinese Journal of Public Health, 2016, 32(6): 828-831.
贵阳市2013—2015年手足口病患儿EV71病毒VP1、VP4基因特征分析
张正君1, 杨兴林2, 黄海1     
1. 贵州医科大学检验学院, 贵州 贵阳 550004 ;
2. 贵阳市公共卫生救治中心
收稿日期: 2016-02-17; 数字出版日期: 2016-05-17 14:34.
作者简介: 张正君(1984-), 男, 甘肃白银人, 主管检验师, 硕士, 研究方向:临床检验诊断学。
通讯作者: 黄海, E-mail:hwanghai@126.com
摘要: 目的 分析贵州省贵阳市2013—2015年手足口病患儿肠道病毒71型(EV71)VP1和VP4基因特征, 为手足口病疫苗的选用和临床诊治提供参考依据。 方法 采集2013年8月—2015年4月在贵阳市第五人民医院就诊的120例手足口病轻症患儿鼻咽拭子和(或)粪便标本进行EV71病毒VP1和VP4全序列的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增和测序, 并与美国国立生物技术信息中心公布的EV71 A、B、C基因型代表株进行系统进化分析, 根据进化分析结果对此2个片段随机抽取20例与其他地区相同基因型进行氨基酸位点变异分析。 结果 所有样本病毒株均为C4基因亚型, 与2008年北京、上海、安徽以及2011年深圳分离株成簇, 20例EV71病毒株在VP1和VP4氨基酸位点变异与以上城市流行毒株相比, 其中12例样本EV7的VP1片段氨基酸序列293位丙氨酸(A)变异为丝氨酸(S), 其余位点均只有1例样本发生A26T、N31D、N282S突变, 而VP4片段只有1个样本发生K52R突变。 结论 贵阳市2013—2015年手足口病患儿的EV71流行株均属C基因型的C4亚型, VP1片段常见A293S、A26T、N31D和N282S突变, VP4片段偶有K52R突变。
关键词： 手足口病     肠道病毒71型(EV71)     VP1     VP4     基因特征    
Sequence analysis of VPl and VP4 genes of enterovirus 71 strains isolated from children with hand-foot-mouth disease in Guiyang city, 2013-2015
ZHANG Zheng-jun1, YANG Xing-lin2, HUANG Hai1     
College of Laboratory Medicine, Guizhou Medical University, Guiyang, Guizhou Province 550004, China
Abstract: Objective To analyze the characteristics of the VP1 and VP4 genes of enterovirus 71(EV71)isolated from the children with hand-foot-mouth disease(HFMD)during 2013-2015 in Guiyang city of Guizhou province and to provide references for HFMD vaccine selection and clinical diagnosis and treatment of the disease. Methods Nasopharyngeal swab and/or faeces specimens were collected from 120 children seeking medication for mild HFMD at the Fifth People's Hospital of Guiyang City from April 2013 to August 2015 for the isolation of EV71.Then, the VPl and VP4 genes of the isolated EV71 strains were amplified and sequenced with reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR).The identified sequences were compared with those of A, B, C genotype references of EV71 strains from GenBank issued by National Center for Biotechnology Information of United States with phylogenetic tree analyses.In addition, nucleotide and amino acid alignments of VPl and VP4 genes of the EV71 strains isolated from randomly selected 20 cases were compared with those identified in other regions in China based on the results of phylogenetic tree analyses. Results All isolated EV71 strains belong to subgenogroup C4, clustered with those isolated from the HFMD cases in Beijing and Shanghai city and Anhui province in 2008 and in Shenzhen city in 2011.Compared with the strains isolated in other regions in China, the mutation of amino acid 293 (alanine to serine [Ala→Ser]) in the VP1 protein was observed for the strains from 12 of the 20 selected cases and that of amino acid 26 (alanine to threonine [Ala→Thr]), 31 (asparagine to aspartic acid [Asn→Asp]), and 282 (Asn→Ser) in the VP1 protein were observed in one of the 20 selected cases, respectively; whereas only one mutation of amino acid 52(lysine to arginine [Lys→Arg])in the VP4 protein was observed in one of the 20 selected cases. Conclusion The prevalent EV71 strains isolated in Guiyang city belong to subgenogroup C4 and common amino acid point mutations in VP1 for the isolated strains are 293(Ala→Ser), 26(Ala→Thr), 31(Asn→Asp), and 282(Asn→Ser)and a rare point mutation in VP4 is 52(Lys→Arg).
Key words: hand-foot-mouth disease     enterovirus 71     VP1     VP4     gene characteristics    

手足口病是由多种人肠道病毒引起的一种儿童常见传染病，其中肠道病毒71型(enterovirus，EV71)是儿童手足口病的主要病原之一，能引起多种临床症状，除手、足、口腔等部位出现小疱疹或小溃疡的手足口病外，少数患儿可引起心肌炎、无菌性脑膜脑炎、神经源性肺水肿等与神经系统相关的并发症[1-2], 其病死率和致残率较高，被喻为21世纪的“脊髓灰质炎”[3-5]。EV71基因组含有VP1、VP2、VP3、VP4共4个衣壳蛋白，VPl、VP2和VP3暴露在病毒外壳的表面，其中衣壳蛋白VP1是该病毒主要的中和决定因子，决定病毒的抗原性。有研究表明，VP1基因具有与病毒血清型完全对应的遗传多样性[6-7]，是EV71基因分型和遗传进化分析的重要对象。而VP4则包埋在病毒外壳的内侧，与病毒核心紧密连接，这决定了VP4蛋白具有保守结构[8]。由于中国大陆地区自1998年后流行的EV71均为C4亚型[9]，因而疫苗研发机构全部选取C4亚型毒株为研发EV71灭活疫苗的候选株。为此，本研究对贵州省贵阳市第五人民医院2013—2015年确诊的120例手足口病轻症患儿进行了EV71病毒VPl和VP4核苷酸序列及氨基酸位点变异分析，旨在为手足口病疫苗的选用和临床诊治提供参考依据。

1 材料与方法 1.1 标本来源

采集2013年8月—2015年4月在贵阳市第五人民医院确诊的120例手足口病轻症患儿鼻咽拭子和(或)粪便标本。

1.2 主要试剂与仪器

肠道病毒逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)试剂盒和RNA提取试剂盒(上海之江公司)；RT-PCR试剂盒和凝胶DNA提取试剂盒(大连宝生物公司)；EV71病毒VPl和VP4片段扩增引物由大连宝生物公司合成。Roche LightCycler® 480II实时荧光定量PCR系统(德国罗氏公司)；Tanon GIS System凝胶成像仪(上海天能公司)。

1.3 EV71病毒VPl和VP4全基因核苷酸序列扩增

按试剂盒操作说明书提取RNA并进行EV71的鉴定，采用大连宝生物公司一步法RT-PCR试剂盒进行VPl、VP4全基因序列扩增。EV71 VPl片段引物序列为：F：5'-GCAGCCCAAAAGAACTTCAC-3'，R：5'-AAGTCGCGAGAGCTGTCTTC-3'；EV71 VP4片段引物序列为:F：5'-CCGGTGTGCAACAGAGCAAT-3'，R：5'-TGCGCCACTCGATCACTGTA-3'。产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳分析结果，其中VPl扩增片段为1082bp，VP4扩增片段为350 bp。

1.4 EV71病毒VPl、VP4基因序列测定与分析

将EV71病毒VPl和VP4片段PCR扩增产物纯化，送大连宝生物公司进行序列测定。序列结果用Mega 4.0软件邻接法(N-J法)构建系统发生树，用于构建系统发生树的EV71各基因型代表株的参比序列均来自美国国立生物技术信息中心的GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。根据进化分析结果对此2个片段随机抽取的20例手足口病患儿与其他地区相同基因型进行氨基酸位点变异分析。

2 结果 2.1 EV71病毒VP1、VP4片段RT-PCR结果(图 1)

结果显示，手足口病患儿EV71病毒VPl和VP4片段分别为1082和350bp, 与目的片段一致。

注：M：DNA mark；1~8号：检测样本。 图 1 手足口病患儿EV71病毒VP1和VP4片段RT-PCR检测

2.2 EV71病毒VPl、VP4区基因进化分析(图 2、3)

对EV71病毒的VPl、VP4进行基因进化树分析，结果显示，贵阳市2013—2015年手足口病患儿EV71毒株相对集中，且与2008年安徽省阜阳市的流行株以及2008、2009、2010年上海、北京EV71流行株高度同源，在进化树中均与C4亚型代表株聚成一簇，提示贵阳市2013—2015年的EV71毒株仍然为在中国大陆主要流行的C4亚型。

图 2 贵阳市2013—2015年手足口病患儿EV71病毒VP1基因进化树分析

图 3 贵阳市2013—2015年手足口病患儿EV71病毒VP4基因进化树分析

2.3 EV71病毒VPl、VP4区氨基酸位点变异分析(表 1)

随机抽取20例手足口病患儿EV71与2008—2011年中国大陆流行毒株比较，结果显示，其中12例样本EV71VP1片段氨基酸序列293位丙氨酸(A)变异为丝氨酸(S)，其余位点只有1例样本发生A26T、N31D、N282S突变, 而VP4片段只有1个样本发生K52R突变。

表 1 贵阳市手足口病患EV71病毒VPl、VP4片段氨基酸位点变异分析

3 讨论

本研究证实贵阳市2013—2015年120例手足口病患儿EV71型毒株相对集中，与2008年安徽省阜阳市的流行株以及2008、2009、2010年北京、深圳、上海EV71型流行株高度同源，在进化树中属于C4亚型。随机选择20例样本EV71型与2008-2011年北京、上海、深圳、安徽等流行毒株比较，结果显示，20例样本的VP1片段氨基酸序列第22号均为组氨酸(H)，与流行毒株FJ606448.1、EU703814.1、JQ736684.2一致，但与深圳市流行毒株不一致，AY465356.1 VP1片段氨基酸序列第22号为谷氨酰胺(Q)；VP1片段氨基酸序列第98号均为谷氨酸(E)，与流行毒株FJ606448.1、AY465356.1、JQ736684.2一致，但与安徽流行毒株不一致，EU703814.1 VP1片段氨基酸序列第98号为赖氨酸(K)；4号样本VP1片段氨基酸序列第26号丙氨酸(A)变异为苏氨酸(T)；7号样本VP1片段氨基酸序列第31号由天冬酰胺(N)突变为天冬氨酸(D)；16号样本VP1片段氨基酸序列第282号由天冬酰胺(N)突变为丝氨酸(S)，与上海分离株报道的N282S突变一致[10]。此外，20例样本中的12例EV71病毒VP1片段氨基酸序列293位丙氨酸(A)变异为丝氨酸(S)，而VP4片段只有16号样本第52号氨基酸由赖氨酸(K)变异为精氨酸(R)。

综上所述，贵阳市2013—2015年手足口病患儿中的EV71病毒流行株均属C基因型的C4亚型，其中VP1片段常见A293S、A26T、N31D和N282S突变，VP4片段偶有K52R突变。由于本次研究收集到的临床标本相对较少，因此对于系统地发现和检测贵阳市EV71病毒VP1和VP4的核苷酸和氨基酸的序列特征及其的突变规律具有一定的欠缺；此外，本研究分析的手足口病病例均为轻症患儿，导致了本研究未能发现EV71型重型毒株或死亡毒株的核苷酸和氨基酸的序列特征。因此，在今后的研究中应加大标本的检测量，并广泛联合辖区内的医疗机构收集引起患儿神经系统疾病的重型毒株或死亡毒株作进一步分析。

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