2016, Vol. 32
2. 辽宁省疾病预防控制中心
腹泻病是全球性公共卫生问题之一，据世界卫生组织统计，每年全球约有17~20亿腹泻患者，约有76~150万< 5岁儿童因腹泻病死亡，成为仅次于肺炎的死亡原因[1]。感染性腹泻病包括沙门菌肠炎、肠致泻性大肠杆菌肠炎、致泻性弧菌肠炎、弯曲菌肠炎、小肠结肠炎耶尔森菌肠炎、轮状病毒(rotavirus, RV)肠炎、诺如病毒(norovirus，NV)肠炎、肠腺病毒(adenovirus，AdV)肠炎、隐孢子虫病、蓝氏贾第鞭毛虫肠炎等[2]。本研究于2007—2010年在天津市不同地区5所哨点医院采集感染性腹泻患者粪便样本，研究感染性腹泻的病原构成及其表型和分子生物学等特征，现将结果报告如下。
1 对象与方法 1.1 对象2007—2009年在天津市儿童医院和位于滨海、近郊和远郊的4所综合医院，按照卫生部《感染性腹泻诊断标准》(WS271-2007)[3]临床诊断，基于腹泻症候对463例患者开展感染性腹泻病毒和细菌病原调查。细菌性痢疾耐药性检测采集在每年5~10月肠道门诊的就诊病例样本进行，病例的临床症状、流行病学史及便常规检测符合《细菌性痢疾、阿米巴痢疾诊断标准及处理原则》[4]。
1.2 主要试剂与仪器RV和NV抗原检测酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA)试剂(兰州生物制品研究所，美国DakoCytomation公司IDEIATM norovirus试剂盒)。Real-time reverse transcription PCR(RT-PCR)试剂盒、核酸分子量Marker、Taq DNA聚合酶、dNTP(大连TaKaRa宝生物公司)，溴化乙锭(美国MBI公司)，PCR引物合成(上海英骏公司)(表 1)。RV A组(G3、P8型)和NV(GⅠ、GⅡ型)阳性对照(中国疾病预防控制中心病毒所提供)。细菌检测用培养基和试剂(美国BD、英国OXOID、北京陆桥、天津诺凡公司，有效期内使用)。GENE AMP PCR-9700型扩增仪(美国Applied Biosystems公司)、MITSUBISHIP 91型凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)和BIOMERIEUX easy MAG自动核酸提取仪(法国梅里埃公司)。
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表 1 PCR所用引物 |
1.3 方法 1.3.1 样本采集
采集病例粪便标本约5 g(5 mL)无菌粪便采样杯，优先采集就诊时未使用抗生素的病例。用于病毒检测的标本采集后30 min内放置在-20℃冰箱中。细菌检测标本用5支无菌棉拭多点采集粪便，插入Carry-Blair运输培养基，置4℃冷藏包，当日送天津市疾病预防控制中心实验室检测。
1.3.2 病毒检测(引物表 1)RV和NV抗原检测采用ELISA方法，RV、NV抗原检测阳性标本采用反转录PCR(RT-PCR)方法进行型别分析。RV分型采用2管分别进行G和P分型。NV(GI)、NV(GⅡ)和札如病毒分型，分别使用3对分型引物检测。AstV分型RT-PCR和AdV分型PCR反应条件同NV，前者引物为Mon269、Mon270，后者为Ad1、Ad2。AdV和星状病毒(astrovirus，AstV)PCR阳性产物的序列测定和分析由上海英骏生物技术有限公司完成。将DNA序列片段进行Blast比对，序列结果应用DNA Star 5.01整理并进行核苷酸序列同源分析，用MEGA 4.0软件对16株AdV序列结果与Gen Bank参考株构建基因亲缘性关系树。
1.3.3 细菌检测采集的粪便标本划线接种选择性培养基，进行志贺菌、致泻大肠杆菌、沙门菌、弯曲菌检测，同时将拭子放入增菌液中培养后再接种选择性培养基，进行小肠结肠炎耶尔森菌、弧菌、嗜水气单胞菌、类志贺邻单胞菌等细菌检测。挑取可疑菌落接种克氏双糖(Kligler iron agar, KIA)、动力-吲哚-尿素(motility indol urea medium base, MIU)、氧化酶及ortho-nitrophenyl-β-d-galactoside(ONPG)初步鉴定，符合生化特征的菌落再行系统生化鉴定，并采用玻片凝集法进行血清分型。痢疾志贺氏菌耐药性检测采用Kirby-Bauer平板纸片扩散法，抗菌药物包括氨苄西林、哌拉西林、庆大霉素、左氧氟沙星、阿米卡星、复方新诺明、头孢噻肟、头孢他啶、头孢唑啉、替卡西林+棒酸、环丙沙星、诺氟沙星、美罗培南和亚胺培南等14种，耐药程度以抑菌环直径判定[5]。
1.4 统计分析采用Epi Data 3.1建立数据库，双人录入并进行核对，用SPSS 11.5统计软件包进行数据统计分析。依据数据资料的特征，采用χ2检验，Fisher确切概率法，检验水准为0.05。
2 结果 2.1 病毒检测情况463例患者粪便标本，进行病毒检测，其中428例同时进行病原菌检测。164例检出病毒，阳性率35.4%。其中69例(14.9%)检出NV，38例(8.2%)检出RV，26例(5.6%)检出AdV，7例(1.5%)检出AstV，1例(0.2%)发现札如病毒。混合感染存在，7例(1.5%)为NV/AstV，6例(1.3%)感染RV/NV，4例(0.9%)感染RV/AstV，3例(0.7%)是NV/AdV，2例(0.4%)为RV/NV/AstV，1例(0.2%)感染RV/肠道AdV。
2.2 细菌检测情况178例检出肠道病原菌，阳性率41.6%(178/428)。47例(11.0%)检出志贺菌，25例(5.8%)发现肺炎克雷伯杆菌，13例(3.0%)检出副溶血弧菌，12例(2.8%)发现铜绿假单胞菌，7例(1.6%)检出沙门菌，5例(1.2%)为布拉克枸橼酸杆菌。此外，奇异变形杆菌和屎肠球菌分别在4例(0.9%)患者检出，弗氏枸橼酸杆菌、阴沟肠杆菌、变形杆菌、嗜水气单胞和雷氏普罗威登斯菌分别在3例(0.7%)患者检出，大肠埃希菌、类志贺邻单胞菌、霍乱弧菌(非O1非O139)和小肠结肠炎耶尔森菌分别在2例(0.5%)患者检出。
2.3 病毒基因型特征(表 2、图 1)|
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表 2 轮状病毒G/P基因型分布 |
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图 1 天津市2009年Adv毒株亲缘性关系树 |
> 5岁患者中检出112例RV，RV的基因型以G3和P[8]为主，分别占29.5%和24.1%；检出61例NV，基因型以GⅡ为主，占78.3%；未分型占21.7%。RV和NV均阳性10例患者中，7例RV为未分型，2例P[8]型，1例P[6]型，没有G基因型出现；4例NV为未分型，其余6例为GⅡ型。≤5岁患者RV的基因型以G3和P[8]为主, 分别占34.7%和26.3%, NV基因型以GⅡ为主, 占83.8%，未分型占16.18%。与> 5岁儿童不同, RV和NV均阳性15例患者中，8例RV为G型；12例NV为GⅡ型。16例AdV阳性PCR产物进行序列测定，结果8例为AdV40型, 参考序列为X51782、AB330121；6例为AdV41型, 参考序列为X51783、AB330122；1例为AdV1型, 参考序列为AB330082、AF534906；1例为AdV7型, 参考序列为GU230898、AY601634，相似度均在96%～99%(图 1)。3株AstV PCR产物直接测序, 经Blast比对为1型。
2.4 痢疾志贺菌耐药情况(表 3)采集到495例，> 5岁痢疾患者粪便标本，58例检出志贺菌，检出率为11.7％。其中福氏26例，宋内31例，未分型1例。毒素以肠毒素Ⅰ、Ⅱ型居多，占53.5％(31/58)，而17.2％(10/58)未检出志贺菌肠毒素。58株志贺菌普遍耐药。对复方新诺明的耐药率高达94.8％(55/58)，对氨苄西林的耐药率为58.6%(34/58)，对诺氟沙星耐药率为34.5％(20/58)。将志贺菌分型，福氏志贺菌对复方新诺明的耐药率为88.5％(23/26)，对氨苄西林耐药率为26.9％(7/26)，对诺氟沙星耐药率为4.0％(1/25)，对环丙沙星耐药率为3.8％(1/26)；宋内志贺菌对复方新诺明的耐药率为100.0％(31/31)，对氨苄西林耐药率为87.1％(27/31)，对诺氟沙星耐药率为61.3％(19/31)，对环丙沙星均敏感。2型志贺菌对氨苄西林和诺氟沙星的耐药率差别均具有统计学意义(χ2=21.272，P < 0.001；χ2=19.784，P < 0.001)，宋内志贺菌的耐药率高于福氏志贺菌。
3 讨论2007年在12个涉农区县的调查，传染病漏报率高达78.0%，其后2年分别为42.7%和49.1%[6]。事实上，感染性腹泻疾病始终是天津市难以回避的公共卫生问题。天津市感染性腹泻病原复杂。2009年传染病监测技术平台项目的实施，将开展2年的病毒性腹泻研究扩展到细菌性腹泻。基于腹泻症候群病原调查，2009—2010年检出多种病毒和病原菌，腹泻症候群患者病毒阳性率35.4%，肠道病原菌阳性率为41.6%。检出病毒包括NV、RV、肠道AdV和札如病毒，并且存在多种病毒的混合感染。检出的肠道病原菌涉及志贺菌、副溶血弧菌、沙门菌等10余种，其中包括少有发现的霍乱弧菌(非O1非O139)、小肠结肠炎耶尔森菌、创伤弧菌、温和气单胞菌等，混合感染更是复杂。
研究发现，病毒性腹泻的病原仍是NV和RV为主，与中国国内总体监测[7]类似。RV的基因型多样化，总体上以G3和P[8]为主，尚未发现辽宁、新疆乌鲁木齐逐渐成为优势的G9/P[8]基因型组合[8-9]。NV的基因型与2008年调查结果一致[10]，仍以GⅡ为主，但是在2012年天津市某居民小区发生的水源性急性胃肠炎暴发，证实是GⅠ和Ⅱ型共同引发。经测序，GⅠ型为GⅠ.14基因型，GⅡ型涉及GⅡ.8型、GⅡ.6型和GⅡ.2型[11]。国内近年时有NV引发的急性胃肠炎暴发，广东、江苏、北京、四川等省市多次报告，其主要病原是GⅡ.4／Sydney _2012变异株[12-13]。天津市的发现提示，病原基因型仍在变化，病原基因型别种类更为复杂。细菌性腹泻中志贺菌常见，多为宋内和福氏型，且以肠毒素Ⅰ、Ⅱ型居多。志贺菌耐药普遍，对复方新诺明的耐药率高达94.8％，对氨苄西林的耐药率为58.6%，对诺氟沙星耐药率为34.5％，宋内志贺菌的耐药率更高，多重耐药普遍。结合感染性腹泻病患者病原学分析，在> 5岁和≤5岁患者中RV和NV病毒性腹泻分别高达12.9%~27.1%和6.3%~18.0%，而治疗上依然广泛使用抗生素，辅以黏膜保护剂、止泻药及中药，不仅促成耐药发展，亦引发肠道菌群失调，导致更为复杂的疾病现象。正确选择用药，遏制抗生素盲用、泛用愈加紧迫。
本文工作还有雷玥和区县疾病预防控制中心、监测医院人员参加，兰州生物制品研究所孙祖勇等同仁的帮助。
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