心肌纤维化又称心肌钙化，是糖尿病心肌病的主要特征之一，是心脏疾病发展到一定阶段的病理特征。黄精(Polygonatum sibiricum Red)属于百合科(Liliaceae)黄精属(Polygonatum)多年生草本植物的干燥根茎, 是中国传统的药食同源植物^[1]，在民间已经被用于治疗糖尿病，其活性成分主要有糖类、甾体皂苷、黄酮、蒽醌类化合物、氨基酸和微量元素^[2]，其中重要组成部分是黄精多糖(Polygonatum sibiricum polysaccharides.PSP)。研究表明，黄精多糖具有抗脂质过氧化、抗肿瘤、抑制炎症反应和细胞凋亡、调节免疫、抗氧化损伤及对实验性糖尿病鼠的心、肾、脑组织具有保护作用^[3～9]，但其治疗糖尿病心肌病的机制尚未明确。本研究通过观察不同剂量黄精多糖对I型糖尿病心肌病大鼠模型心肌组织骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7，BMP-7)、转化生长因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)、Smad2/3、Smad7表达影响，探讨黄精多糖干预糖尿病心肌纤维化的可能机制。结果报告如下。

黄精提取物(南京景竹生物科技有限公司)，黄精多糖≥50%，检验批号：140 704；兔抗大鼠BMP-7抗体(北京博奥森公司)；兔抗大鼠TGF-β1、smad2/3、smad7抗体(武汉博士德生物工程有限公司)；生物标记山羊抗兔lgG二抗试剂盒(北京中杉金桥公司)；Masson染色试剂盒(北京雷根有限公司)；甘油三酯、游离脂肪酸、总胆固醇试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司)。三诺安准血糖检测仪(深圳市三诺电子有限公司)；CIAS-1000细胞图像分析系统(北京恒大图像视觉有限公司)；全自动免疫组化染色仪(美国DAKOCYTOMSTION公司)。

50只体重为250~300 g健康雄性SD大鼠(辽宁医学院实验动物中心)，许可证号：SCXK(辽)2009-0004。适应性饲养1周后，随机选取10只腹腔注射等量柠檬酸缓冲液作为对照组，其余大鼠一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)35 mg/kg(1%的STZ溶于0.1 mmol/L柠檬酸缓冲液中，pH=4.5)，72 h后，尾静脉采血检测空腹血糖，选取血糖≥16.7 mmol/L造模成功的大鼠随机分为模型组、黄精多糖250、500、1 000 mg/kg组，黄精多糖组分别给予相应剂量黄精提取物灌胃，对照组和模型组给予等体积生理盐水灌胃，连续12周。常规饲料饲养，实验期间所有大鼠自由饮水进食。

试验结束时, 所有大鼠禁食12 h, 称体重，尾静脉采血，采用血糖仪测大鼠空腹血糖；电子天平称量大鼠心脏质量，左心室质量，计算大鼠心脏质量指数(the heart mass index，HMI)，左心室质量指数(left ventricular mass index，LVMI)。

用20％乌拉坦(5 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，分离大鼠颈总动脉，采用逆行插管到左心室，通过压力换能器记录左心室收缩压(left ventricular systolic pressure，LVSP)，左室舒张末压(left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)，左室内压最大上升和下降速率(±dp/dt_max)。

全自动生化分析仪及相应试剂盒测定血浆总胆固醇(total cholesterol, TC)，甘油三酯(triglyceride, TG)，游离脂肪酸(free fatty acid, FFA)含量。

(1)苏木素-伊红(hematoxylin and eosin, HE)染色：将固定24 h的小块左心室组织脱水、透明、浸蜡、定向包埋。石蜡切片厚4μm，捞片，60℃烤片2 h，二甲苯脱蜡，梯度乙醇洗，蒸馏水洗，HE染色，梯度乙醇洗，二甲苯透明，中性树胶封固，光镜观察，拍照。(2)Masson染色：石蜡切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇洗，蒸馏水洗，weiger氏铁苏木素染色，流水稍洗，1%盐酸酒精分化，流水冲洗，丽春红品红溶液染色，蒸馏水洗，1%磷钼酸溶液处理，苯胺蓝溶液复染，1%磷钼酸溶液处理，梯度乙醇洗，二甲苯透明，中性树胶封固，光镜观察，拍照。

采用免疫组化方法，依照试剂盒说明书进行，防脱切片60℃烤片2 h，常规脱蜡至水，柠檬酸钠缓冲液中高压修复抗原，3%H₂O₂去离子水孵育，滴加1：100稀释一抗，4℃冰箱过夜，Envison法滴加二抗，3, 3-二氨基苯联胺显色，苏木素复染，梯度乙醇洗，二甲苯透明，中性树胶封固，光镜观察，拍照。对照组用磷酸盐缓冲液代替一抗，细胞浆或细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性表达，在400倍光镜下，每张切片随机选取5个视野图像，采用Image-Pro plus Version 6.0测量切片BMP-7、TGF-β1、Smad2/3、Smad7的光密度值，以平均光密度值代表各因子表达量。

数据均以x±s表示，采用SPSS 16.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用最小显著性差法。P < 0.05为差异有统计学意义。

对照组大鼠，体格强壮，活泼好动，反应敏锐，眼睛鲜红有神，毛色光泽。模型组大鼠，消瘦，目光呆滞，萎靡不振，生长障碍，尾巴脏湿，脱毛，多饮多食多夜尿，多有糖尿病并发症如白内障，骨关节异常，呼吸道、肠道，皮肤等感染。黄精多糖组大鼠，状态略有恢复。各组大鼠均有死亡，原因多种，模型组和低剂量组大鼠分别死亡3只，对照组、黄精多糖1 000 mg/kg组大各死亡2只，黄精多糖500 mg/kg组大鼠死亡1只。

表 1

表 1 黄精多糖对大鼠心脏指数影响(x±s) 组别(mg/kg) n BW(g) HMI(mg/g) LVMI(mg/g) 对照组 8 300.88±14.20 2.66±0.10 1.77±0.06 模型组 7 202.71±8.14a 4.16±1.14a 2.85±0.09a 黄精多糖 250 7 216.00±4.16b 3.85±0.05b 2.56±0.02b 500 9 225.56±4.15b 3.46±0.27b 2.31±0.10b 1 000 8 235.75±6.18b 3.21±0.07b 2.09±0.02b   注：与对照组比较，a P < 0.05；与模型组比较，b P < 0.05。

表 1 黄精多糖对大鼠心脏指数影响(x±s)

与对照组比较，模型组大鼠体重下降明显，心脏质量指数、左心室质量指数明显升高(P < 0.05)；与模型组比较，黄精多糖各剂量组大鼠体重不同程度上升，心脏质量指数、左心室质量指数不同程度下降(P < 0.05)。

表 2

表 2 黄精多糖对大鼠血流动力学指标影响(x±s) 组别(mg/kg) n LVSP(mm Hg) LVEDP(mm Hg) +dp/dtmax(mm Hg /s) -dp/dtmax(mm Hg /s) 对照组 8 129.88±8.00 5.14±1.03 5 381.43±234.70 5 109.17±199.61 模型组 7 69.06±6.37a 14.60±2.24a 3 933.32±210.64a 3 825.80±214.87a 黄精多糖 250 7 81.34±4.62b 12.14±1.15b 4 377.46±190.99b 4 165.76±186.1b 500 9 98.65±5.09b 8.80±0.61b 4 798.11±104.88b 4 633.63±102.20b 1 000 8 110.59±4.75b 7.22±0.58b 5 019.57±142.33b 4 844.31±78.43b 注：与对照组比较，a P < 0.05；与模型组比较，b P < 0.05;1 mm Hg=0.133 kPa。

表 2 黄精多糖对大鼠血流动力学指标影响(x±s)

与对照组比较，模型组大鼠LVEDP明显上升，而LVSP、±dp/dt_max明显降低(P < 0.05)；与模型组比较，黄精多糖各剂量组大鼠LVEDP下降、LVSP、±dp/dt_max明显升高(P < 0.05)。

表 3

表 3 黄精多糖对大鼠血液生化指标影响(mmol/L，x±s) 组别(mg/kg) n 空腹血糖 甘油三酯 总胆固醇 游离脂肪酸 对照组 8 4.20±0.79 0.77±0.08 1.70±0.15 1.41±0.11 模型组 7 24.81±2.30a 1.95±0.10a 2.77±0.19a 2.57±0.10a 黄精多糖 250 7 22.91±2.06b 1.83±0.10b 2.73±0.17b 2.36±0.14b 500 9 18.81±1.75b 1.34±0.08b 2.48±0.12b 2.13±0.11b 1 000 8 13.28±2.08b 1.14±0.06b 2.35±0.42b 1.76±0.16b   注：与对照组比较，a P < 0.05;与模型组比较，b P < 0.05。

表 3 黄精多糖对大鼠血液生化指标影响(mmol/L，x±s)

与对照组比较，模型组大鼠空腹血糖、甘油三酯、总胆固醇以及游离脂肪酸水平均明显升高(P < 0.05)；与模型组比较，黄精多糖各剂量组大鼠空腹血糖、甘油三酯、总胆固醇以及游离脂肪酸水平均明显下降(P < 0.05)。

对照组大鼠心肌细胞形态正常，心肌纤维排列规则；模型组大鼠心肌细胞肿大，心肌纤维排列紊乱，呈波浪状，并有炎症细胞浸润；与模型组比较，黄精多糖各剂量组大鼠心肌病理损伤程度有所减轻。

图 1

注：A:对照组；B：模型组；C、D：黄精多糖250、1000 mg/kg组。 图 1 黄精多糖对大鼠心肌组织结构影响(Masson染色，×400)

对照组大鼠心肌胶原纤维分布均匀、正常，排列整齐(图 1A)；模型组大鼠心肌胶原纤维增生，排列杂乱，混浊(图 1B)；黄精多糖250 mg/kg剂量组大鼠心肌胶原纤维如模型组损伤仍很严重(图 1C)；黄精多糖1000 mg/kg剂量组大鼠心肌胶原纤维状态较模型组改善明显(图 1D)。

表 4

表 4 黄精多糖对大鼠BMP-7、TGF-β1、Smad2/3、Smad7表达影响(平均光密度，x±s) 组别(mg/kg) n BMP-7 TGF-β1 Smad2/3 Smad7 对照组 8 1.59±0.06 0.79±0.05 0.78±0.05 2.39±0.10 模型组 7 0.73±0.05a 1.28±0.06a 1.45±0.07a 1.36±0.06a 黄精多糖 250 7 0.96±0.07b 1.14±0.07b 1.26±0.05b 1.48±0.08b 500 9 1.17±0.05b 0.92±0.08b 1.12±0.04b 1.80±0.09b 1 000 8 1.34±0.05b 0.86±0.03b 0.94±0.09b 2.01±0.08b 注：与对照组比较，a P < 0.05;与模型组比较，b P < 0.05。

表 4 黄精多糖对大鼠BMP-7、TGF-β1、Smad2/3、Smad7表达影响(平均光密度，x±s)

与对照组比较, 模型组大鼠心肌组织中TGF-β1、Smad2/3表达明显增加、BMP-7、Smad7表达明显下降(P < 0.05)；与模型组比较，黄精多糖各剂量组大鼠心肌组织中TGF-β1、Smad2/3表达下降、BMP-7、Smad7表达升高，差异有统计学意义(P < 0.05)。

糖尿病心肌病是一种特异性心脏病，其发病机制非常复杂，主要病理表现为心肌细胞肥大，左心室壁肥厚，心肌纤维化等，是引起糖尿病患者死亡的主要心脏并发症之一。本研究结果显示，与模型组比较，黄精多糖组大鼠一般状态好转，大鼠空腹血糖有所降低，心肌病理损害明显减轻。提示黄精多糖对大鼠糖尿病心肌损伤具有一定的保护作用。

TGF-β是成纤维细胞的强趋化因子，可诱导其分化为成纤维细胞，刺激胶原蛋白、纤维连接蛋白及蛋白多糖等细胞间质成分的合成，促进细胞间质沉积^[10]。TGF-β已被公认为是器官纤维化的治疗靶标^[11], 在TGF-β的多种异构体中，TGF-β1在体细胞系中所占比例最高、活性最强、功能最多、分布最广泛。胡国梅等^[12]研究发现，糖尿病大鼠心肌的保护机制与下调TGF-β1表达有关。Smads蛋白是TGF-β1下游的关键信号转导因子，直接参与TGF-β的信号传导，在糖尿病状态下TGFβl信号通路激活。心肌纤维化过程中其下游Smad2/3蛋白表达上调^[13]，糖尿病大鼠心脏中抑制型Smad7表达减少^[14]。提示TGF-β1介导的心肌纤维化可被Smad7阻断。BMP-7是分泌性多功能蛋白，属于TGF-β超家族，是一种纤维化的抑制因子，具有显著的抗纤维化作用，研究表明，它与TGF-β1具有相似的作用机制。BMP-7能够通过Smads信号通路间接抑制TGF-β介导纤维化活性^[15]，其在肾脏、肝脏、肺脏、心脏中的纤维化作用均已被证明^[16-19]。

本研究结果显示，糖尿病模型组大鼠心肌组织中TGF-β1 Smad2/3蛋白表达上调，BMP-7、Smad7蛋白表达下调，心肌组织病理损伤严重；黄精多糖干预后，心肌组织中TGF-β1 Smad2/3蛋白表达下调，而BMP-7 Smad7蛋白表达上调，心肌病理损伤减轻。提示，Smad7抑制了TGF-β1 Smad2/3蛋白表达，阻断了TGF-β1/Smads通路，而BMP-7高表达，表明黄精多糖对糖尿病大鼠心肌的保护机制可能部分通过干预BMP-7蛋白表达、影响或抑制TGF-β1/Smad细胞内信号转导实现, 但其具体分子机制仍需进一步深入研究。