中国公共卫生  2016, Vol. 32 Issue (6): 795-798   PDF    
引用本文
牛立慢, 齐妍, 吴倩, 崔雪玲, 柳忠辉, 葛敬岩. TGF-β1参与四氯化碳诱导小鼠急性肝损伤[J]. 中国公共卫生, 2016, 32(6): 795-798.
NIU Li-man, QI Yan, WU Qian, et al . Involvement of TGF-β1 in carbon tetrachloride-induced acute liver injury in mouse[J]. Chinese Journal of Public Health, 2016, 32(6): 795-798.
TGF-β1参与四氯化碳诱导小鼠急性肝损伤
牛立慢, 齐妍, 吴倩, 崔雪玲, 柳忠辉, 葛敬岩     
吉林大学基础医学院免疫学系, 吉林 长春 130021
收稿日期: 2016-02-18; 数字出版日期: 2016-05-17 14:29.
基金项目: 吉林省科技研究计划(JF2012C006-11);吉林省卫生厅科研课题(2011Z040)
作者简介: 牛立慢(1986-), 女, 吉林长春人, 博士在读, 主要从事免疫疾病研究工作。
通讯作者: 葛敬岩, E-mail:gejy@jlu.edu.cn
摘要: 目的 探讨转化生长因子β1(TGF-β1)是否参与四氯化碳(CCl4)诱导的小鼠急性化学性肝损伤过程。 方法 采用腹腔注射CCl4诱导小鼠急性肝损伤, ELISA法检测血清TGF-β1水平, RT-PCR检测TGF-β信号分子Smad2、3的表达。 结果 与橄榄油对照小鼠比较, CCl4处理1d及3d的急性肝损伤小鼠不仅血清转氨酶ALT与AST水平升高, 血清TGF-β1水平也明显升高, 差异有统计学意义(P < 0.01);RT-PCR结果显示, CCl4处理小鼠肝组织TGF-β1 mRNA表达水平明显高于橄榄油对照小鼠, 其受体TβRII及信号蛋白Smad2与Smad3 mRNA也表达升高。 结论 CCl4诱导小鼠急性肝损伤时TGF-β1及其信号分子Smad2、3表达增加, 提示TGF-β1参与CCl4诱导小鼠肝损伤过程。
关键词： 四氯化碳     急性肝损伤     转化生长因子β1     Smad2     Smad3    
Involvement of TGF-β1 in carbon tetrachloride-induced acute liver injury in mouse
NIU Li-man, QI Yan, WU Qian, et al     
Department of Immunology, College of Basic Medical Science, Jilin University, Changchun, Jilin Province 130021, China
Abstract: Objective To investigate whether transforming growth factor-beta 1(TGF-β1) is involved in the process of carbon tetrachloride(CCl4)-induced acute chemical liver injury. Methods Acute liver injury in mouse was induced by intraperitoneal injection of CCl4.The level of serum TGF-β1 in mouse was detected with enzyme-linkde immunosorbent assay(ELISA).The expression of TGF-β1 signaling molecules Smad2, 3 mRNA was examined with reverse transcriptase PCR(RT-PCR). Results Both levels of alanine aminotransferase(ALT), aspartate aminotransferase(AST)and TGF-β1 in serum of mouse increased significantly at 1st and 3rd date after CCl4 treatment (P < 0.01 for all).RT-PCR results showed that the expression of TGF-β1 mRNA in liver was up-regulated significantly in CCl4-treated mouse compared with that in the control mouse treated with olive oil, and the expressions of TβRII, signaling molecules Smad2, 3 mRNA were also obviously up-regulated. Conclusion Levels of TGF-β1 and signaling molecules Smad2, Smad3 increase during CCl4-induced acute chemical liver injury in mouse, which suggest that TGF-β1 is involved in the process of CCl4-induced acute chemical liver injury.
Key words: carbon tetrachloride     acute liver injury     transforming growth factor-β1     Smad2     Smad3    

肝脏是机体重要的代谢器官，极易受各种因素影响而导致损伤，常见原因有病毒性感染、创伤及化学中毒等。四氯化碳(CCl4)是一种典型的肝脏毒剂，由CCl4诱导的小鼠肝损伤是用于研究化学性肝损伤的常用模型[1]。转化生长因子β1(transforming growth factorβ1，TGF-β1)属于TGF-β家族，具有广泛的生物学作用[2-3]。大量研究显示，在慢性肝脏疾病，如病毒性肝炎、肝纤维化、肝癌及肝功能衰竭等疾病发生发展过程中均有TGF-β1表达异常[4-6]，TGF-β1具有抑制肝细胞增殖及促进细胞外基质(extracellular matrix, ECM)产生作用[7-8]，是诱导肝、肺纤维化的关键分子[9]。但是，在CCl4诱导的小鼠急性化学性肝损伤中是否存在TGF-β1蛋白表达异常仍不清楚。因此，本研究通过检测TGF-β1及其信号分子Smad2、3的表达水平变化，探讨TGF-β1是否参与了CCl4诱导的小鼠急性肝损伤过程。

1 材料与方法 1.1 试剂

血清转氨酶alanine aminotransferase(ALT)及aspartate aminotransferase (AST)检测试剂盒由南京建成生物提供。TGF-β1的enzyme-linkde immunosorbent assay(ELISA)检测试剂盒购自eBioscience。橄榄油由北京可丽佩翠橄榄油开发中心提供。CCl4购自北京化工厂。

1.2 CCl4诱导小鼠急性肝损伤模型制备

Balb/c纯系小鼠，雄性18~20g，specific pathogen-free(SPF)级(华阜康科技有限公司，北京)，适应性喂养7天后随机分为橄榄油对照组及CCl4组。橄榄油对照组小鼠腹腔注射10 mL橄榄油/kg体重；CCl4组小鼠腹腔注射0.5 mL CCl4+9.5 mL橄榄油/kg体重，即CCl4与橄榄油的比例为1:19；分别于给药后1 d、3 d、5 d处死小鼠，分离血清用于转氨酶及TGF-β1检测；生理盐水心脏灌流，收获肝脏组织，部分肝脏组织经40 g/L多聚甲醛固定，用于组织病理学检测。

1.3 血清转氨酶ALT及AST测定

取小鼠血清，按试剂盒操作说明书(南京建成生物)检测血清转氨酶ALT及AST，510 nm波长处测光吸收值，根据标准曲线计算样品浓度(U/L)。

1.4 肝脏病理学分析

取小鼠肝左叶组织标本，经4%多聚甲醛固定24小时，常规石蜡包埋，组织病理切片厚度为3~5μm，苏木素-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色，显微镜下观察肝组织的病理损伤程度。

1.5 肝组织中TGF-β1等相关基因检测(表 1)
表 1 PCR所用特异性引物及其序列

采用reverse transcriptase PCR(RT-PCR)取小鼠肝组织20 mg，1mL Trizol(invitrogen)研磨肝组织获取RNA，取1μg抽提总RNA进行逆转录，1μL逆转录产物进行RT-PCR，反应条件：Stage 1：95℃5 min，1 cycle；Stage 2：94℃30s，56℃30s, 72℃1 min，30~35 cycles; Stage 3：72℃10 min。琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，PCR所用特异性引物及其序列见table 1。

1.6 小鼠血清中TGF-β1水平检测

采样ELISA法，小鼠血清用样本稀释液4倍稀释，按照说明书操作，检测小鼠血清中TGF-β1水平。

1.7 统计分析

所有数据均采用SPSS17.0软件进行统计学处理，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 CCl4诱导小鼠急性肝损伤(图 1、2)
注：●橄榄油对照鼠；■CCl4处理鼠；与橄榄油对照组比较，a P<0.05，b P<0.01。 图 1 小鼠外周血ALT及AST水平变化

结果显示，CCl4处理后1 d、3 d模型鼠血清ALT及AST水平明显升高，与对照组比较差异有统计学意义(P < 0.01)。肝组织病理学结果显示，CCl4处理1 d的模型鼠肝门脉及汇管区周围有大面积环状坏死病灶，3 d时肝门脉及汇管区周围坏死面积减小，有大量炎症细胞浸润；5d时可见肝小叶门脉损伤区明显修复(图 2)。上述结果表明CCl4成功诱导了小鼠急性肝损伤。

注：箭头表示肝损伤区域 图 2 HE染色观察小鼠肝组织病理学变化

2.2 CCl4诱导急性肝损伤小鼠TGF-β1水平变化(图 3、4)
注：○橄榄油对照鼠；●CCl4处理鼠；与橄榄油对照组比较，a P<0.05，b P<0.01。 图 3 小鼠外周血TGF-β1水平变化

图 4 小鼠肝组织TGF-β1 mRNA表达变化

结果显示，1 d及3 d的CCl4模型组小鼠血清TGF-β1水平明显升高，5 d开始下降。RT-PCR结果显示，CCl4模型鼠肝组织中TGF-β1 mRNA表达水平也明显高于对照组。

2.3 CCl4处理小鼠肝组织TβIIR及Smads表达(图 5)
图 5 小鼠肝组织TβIIR及Smad2、3 mRNA表达变化

Smad2、3参与了TGF-β信号传导，因此，进一步检测小鼠肝组织中TGF-βII型受体(TβIIR)及Smad2、3 mRNA表达变化。结果显示，CCl4诱导小鼠肝损伤时TβIIR及Smad2、3 mRNA表达均明显高于对照组。提示CCl4诱导小鼠急性肝损伤时TGF-β的Smads信号传导途径被活化。

3 讨论

TGF-β家族由TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3等组成，其中TGF-β1在组织中表达最丰富，并在多种生理病理过程中扮演着重要角色[10-11]。TGF-β受体属于丝氨酸/苏氨酸激酶型受体，TGF-β首先与TβIIR结合，再招募和活化TGF-βI型受体(TβIR)，从而激活哺乳动物果蝇Mad基因类似基因(mammalian homologs of the Drosophila Madgene，Smad)传导信号[12]。根据Smad蛋白在信号转导中的作用，可将其分为三类：膜受体激活的Smads，包括Smad 1、2、3、5和8；通用Smad，目前发现的只有Smad4；抑制性Smad，包括Smad6、7。其中Smad 1、5、8负责骨形成蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)信号传导，Smad2、3则是TGF-β信号传导途径的重要分子，并在肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)的激活及其激活后产生ECM中均发挥重要[13-14]。

大量研究表明，TGF-β1/Smads信号通路参与了多种疾病的发生发展进程，如TGF-β1可通过Smad2/3信号途径促进卵巢癌的迁移[15]；在肾脏纤维化过程中TGF-β1/Smad3信号传导通路具有重要意义[16]；在慢性肝脏疾病及肝纤维中TGF-β1/Smad3信号通路亦发挥重要作用[17]。但TGF-β1蛋白在CCl4诱导急性肝损伤时的表达以及Smads信号传导通路活化情况仍不明确。因此，本实验通过建立CCl4诱导的小鼠肝损伤模型，探讨了TGF-β1及Smad2、3在CCl4诱导的急性肝损伤过程中的表达变化。研究显示，CCl4诱导小鼠急性肝损伤时，血清转氨酶ALT及AST水平明显高于对照小鼠，肝组织HE染色病理分析也显示，CCl4模型鼠肝组织出现大面积坏死，并有炎细胞浸润，表明实验成功建立了CCl4诱导的小鼠急性肝损伤模型。进一步研究发现，CCl4诱导小鼠急性肝损伤时，不仅血清TGF-β1水平升高，肝组织TGF-β1 mRNA表达水平也升高；研究同时显示，CCl4诱导的急性肝损伤小鼠肝组织中TβIIR及Smad2、3 mRNA表达水平亦明显高于对照组，提示CCl4诱导小鼠急性肝损伤时不仅TGF-β1蛋白水平升高，其下游信号传导Smads途径也被激活。

综上所述，CCl4诱导小鼠急性肝损伤时TGF-β1表达水平升高，下游信号蛋白Smad2、3表达亦增加，由于TGF-β1具有抑制肝细胞增殖等作用，因此，本研究认为TGF-β1参与了CCl4诱导小鼠急性肝损伤过程。

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