中国公共卫生  2016, Vol. 32 Issue (5): 624-627   PDF    
引用本文
文涛, 孙葳, 王超, 刘正琦. 发育期铅暴露对仔鼠海马Homer表达和学习记忆影响[J]. 中国公共卫生, 2016, 32(5): 624-627.
WEN Tao, SUN Wei, WANG Chao, et al . Effects of lead exposure on Homer1b/c expression in hippocampus and on learning and memory in offspring rats[J]. Chinese Journal of Public Health, 2016, 32(5): 624-627.
发育期铅暴露对仔鼠海马Homer表达和学习记忆影响
文涛1, 孙葳1, 王超1, 刘正琦2     
1. 辽宁省疾病预防控制中心, 沈阳 110005 ;
2. 内蒙古医学院
收稿日期: 2015-05-06; 数字出版日期: 2015-07-28 15:37.
基金项目: 辽宁省博士科研启动基金(20071063)
作者简介: 文涛(1971-),男,辽宁沈阳人,教授,博士,主要从事毒理学研究工作。
摘要: 目的 探讨发育期慢性低浓度铅暴露对仔鼠海马Homer1b/c蛋白表达变化与学习记忆能力的关系。 方法 30只孕鼠按体重随机分为3组,分别给予双蒸水(对照组)、0.05%、0.20%醋酸铅饮水(低、高剂量染铅组),断乳后仔鼠自行饮用含铅水至生后28 d,生后56 d采用跳台试验测试仔鼠学习记忆能力;Western blot法检测仔鼠生后7、14、21、28 d海马Homer1b/c蛋白表达;血铅和海马脑铅含量用原子吸收光谱法测定。 结果 对照组、0.05%、0.20%醋酸铅组仔鼠跳台试验逃离潜伏期分别为(25.71±4.56)、(39.67±5.18)、(64.82±9.73) s,停留潜伏期分别为(234.89±25.85)、(147.15±19.26)、(83.56±14.52)s,与对照组比较,各剂量染铅组仔鼠逃离潜伏期明显延长、停留潜伏期明显缩短(P<0.05);与对照组比较,生后7、14、21、28 d时,0.05%和0.20%醋酸铅组仔鼠海马Homer1b/c蛋白表达分别为(0.607±0.022)、(0.825±0.054)、(0.583±0.015)、(0.557±0.011)和(0.540±0.021)、(0.574±0.018)、(0.471±0.009)、(0.412±0.007)明显降低(P<0.05)。 结论 慢性铅暴露可降低仔鼠被动回避反应的学习和记忆能力,其机制可能与染铅所致仔鼠海马Homer1b/c蛋白表达下降有关。
关键词： 海马     Homer1b/c蛋白     学习记忆     被动回避反应    
Effects of lead exposure on Homer1b/c expression in hippocampus and on learning and memory in offspring rats
WEN Tao1, SUN Wei1, WANG Chao1, et al     
Liaoning Provincial Center for Disease Control and Prevention, Shenyang, Liaoning Province 110005, China
Abstract: Objective To observe the effect of low level lead exposure during pregnant on the expression of Homer1b/c in hippocampus and the relationship between the exposure and learning and memory in offspring rats. Methods Thirty pregnant rats were randomly divided into 3 groups:a control group fed with doubly distilled water and two treatment groups exposed to 0.05% and 0.2% lead acetate(PbAc) in drinking water during pregnancy and lactation. After weaning, the offspring rats of treatment groups were directly fed with drinking water to postnatal 28 day as their dams.Step-down test was used to observe the change in learning and memory for passive avoidance response at postnatal 56 days.Western blot was used to detect the protein expression of Homer1b/c in hippocampus of offspring rats at postnatal 7, 14, 21, and 28 day, respectively.The contents of lead in blood and hippocampus were determined with atomic absorption spectrophotometer at postnatal 28 days. Results Compared to the controls, the offspring rats exposed to 0.05% and 0.2% PbAc showed significantly longer average escaping latency(39.67±5.18 and 64.82±9.73 vs. 25.71±4.56 seconds) and significantly shorter average remaining latency(147.15±19.26 and 83.56±14.52 vs. 234.89±25.85 seconds) (all P<0.05).The expressions of Homer1b/c in hippocampus of the offspring rats exposed to 0.05% and 0.2% PbAc were 0.607±0.022, 0.825±0.054, 0.583±0.015, and 0.557±0.011and 0.540±0.021, 0.574±0.018, 0.471±0.009, and 0.412±0.007 at postnatal 7, 14, 21, and 28 day, with a decreased tendency compared to those of the control group(P<0.05). Conclusion Chronic lead exposure results in decreases of ability of learning and memory for passive avoidance response in offspring rats and the effect may relate to the decline of homer1b/c expression in hippocampus in rats.
Key words: hippocampus     homer1b/c     learning and memory     passive avoidance response    

Homer蛋白属一类新的突触后致密物质(post-synaptic-density，PSD)蛋白家族成员，是一类联系突触内细胞骨架蛋白、信号蛋白的重要物质，主要分布在中枢神经系统，该蛋白对代谢型谷氨酸受体(metabotropic glutamate receptors，mGluR)在神经元细胞内转运、信号转导过程发挥重要的调控作用，并参与突触可塑性变化及学习记忆等生理过程[1]。研究表明，铅暴露可降低仔鼠海马mGluR5蛋白的表达并导致空间学习记忆能力下降[2]，但mGluR的调控蛋白Homer蛋白在其中的作用尚不清楚。本研究通过建立慢性铅暴露大鼠模型，观察发育期低浓度铅暴露对仔鼠的脑海马组织Homer蛋白表达的变化以及对仔鼠被动回避反应学习记忆能力的影响，探讨发育期铅暴露影响仔鼠学习记忆能力的信号转导机制。结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器

小鼠抗大鼠Homer-1b/c单克隆抗体(美国santa cruz公司)；辣根过氧化酶标记羊抗小鼠二抗(北京中山生物技术有限公司)。ChemiImager 5500自动电泳凝胶成像分析仪(美国Apha Innotech公司)；大鼠电刺激跳台仪(中国医学科学院药物研究所)； AI1200原子吸收光谱仪(加拿大Aurora公司)。

1.2 实验动物与分组处理

Wistar大鼠(中国医科大学动物实验中心)，体重(24 020)g，许可证号：SCXK(辽)2008－0005，90 只，按雄、雌1∶2交配，以次晨发现阴栓者确定为妊娠第0天。将孕鼠随机分为3组，每组10只，分笼饲养。自怀孕第1天起分别饲以双蒸水(对照组)，0.05%、0.20% 醋酸铅水溶液(低、高剂量染铅组)，仔鼠断乳(生后21 d)后自行饮用与其母鼠相同饮用水，生后28 d，改饮双蒸水。

1.3 指标与方法 1.3.1 孕鼠和仔鼠一般状况观察

染铅期间，每天观察大鼠一般状况，包括饮食饮水、精神状态、被毛及大小便状况，定期称量仔鼠体重。

1.3.2 仔鼠血铅、海马铅测定

各组分别随机选取出生后28 d 雄性仔鼠12只，按文献[3]测定血清及脑海马铅含量。

1.3.3 跳台试验

各组分别随机选取出生后56 d雄性子代大鼠12只，按文献[4]进行试验。测试装置为被动回避反应箱，箱底部有铜栅均匀分布，通36 V交流电，内设安全台供大鼠躲避电击。大鼠适应反应箱5 min后开始实验，记录大鼠首次受电击后跳上安全台所需时间(逃离潜伏期，与回避反应的获得有关)、5 min 内跳下圆台次数(错误次数)，作为学习成绩。24 h 后将大鼠放至安全台，此时记下第1次跳下安全台的时间即为停留(触电)潜伏期和5 min 内跳下安全台至铜栅的次数作为小鼠的记忆成绩。如果5 min 内未跳下安全台，错误次数记录为0次，停留潜伏期记录为300 s.

1.3.4 仔鼠海马Homer-1b/c蛋白表达测定

采用蛋白免疫印迹法，各组分别随机选取出生后7、14、21、28 d雄性仔鼠各10只，取海马组织，迅速置于液氮保存，待检。将样品放到4 ℃预冷的裂解缓冲液中，4 ℃超声混匀(6 s×6次)，4 ℃孵育30 min，离心25 000 g，10 min×3次，取上清分装；用Bradford法测蛋白含量，以牛血清蛋白为标准管，用10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质，每孔蛋白加样60 μg，恒压160 v电泳至胶底部，转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h后，分别加入1:100抗大鼠homer-1b/c一抗，抗(-actin单抗，37 ℃摇床1 h，PBST(phosphate buffer solution-Twen20)洗涤3次，10 min/次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IGg-HRP，37 ℃摇床1 h，PBST洗涤3次，10 min/次，采用化学发光剂显色，X线片暗室曝光，将蛋白印迹显影图扫描，以Homer-1b/c与相应内参(β-actin) 的灰度值比值代表相对蛋白含量。

1.4 统计分析

数据采用(x±s)表示，应用SPSS 18.0软件进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较用SNK-q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果 2.1 染铅对大鼠一般状况影响

实验期间，对照组和低、高剂量铅暴露组孕鼠进食和饮水正常；各组之间孕鼠体重未见明显差异，喂养过程中未发现孕鼠有明显铅中毒症状和体征；均为自然分娩，未见畸胎和死胎。生后21、56 d时，铅暴露组与对照组仔鼠体重未见明显差异。

2.2 染铅对仔鼠血铅和海马脑铅含量影响(表 1)
表 1 发育期铅暴露对仔鼠血铅和海马脑铅含量影响(x±s，n=12)

于仔鼠生后28 d进行血铅和大脑海马铅含量测定，结果显示，与对照组比较，各剂量染铅组仔鼠血铅和海马铅含量明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与低剂量染铅组比较，高剂量染铅组仔鼠血铅和海马铅含量明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2 染铅对仔鼠学习记忆能力影响(表 2)
表 2 发育期铅暴露对仔鼠学习和记忆能力影响(x±s，n=10)

与对照组比较，仔鼠跳台试验逃离潜伏期明显长延长，停留潜伏期则明显缩短，差异有统计学意义(P＜0.05)，呈剂量效应关系；与对照组比较，仔鼠学习和记忆错误次数均明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 染铅对仔鼠海马Homer1-b/c蛋白表达影响(图 1、表 3)
注：1：对照组，2、3：0.05%、0.20%醋酸铅组。 图 1 发育期铅暴露对仔鼠海马Homer1-b/c蛋白表达影响

表 3 发育期铅暴露对仔鼠海马Homer-1b/c蛋白表达影响(x±s，n=10)

结果显示，与对照组比较，染铅组仔鼠海马Homer-1b/c蛋白表达明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)，呈剂量效应关系。

3 讨 论

铅是环境中广泛存在的重金属毒物，可经呼吸道、消化道和皮肤进入人体内，引起听力及视力障碍、周围神经病变和铅毒性脑病，其中最主要的是神经毒性。胚胎及婴幼儿期对铅毒性更为敏感。本研究通过饮水途径使孕鼠和仔鼠在发育期暴露于低浓度铅，复制仔鼠铅暴露模型，结果表明与对照组比较，发育期染铅组仔鼠生后28 d时脑海马铅及血铅含量均明显升高；跳台试验结果显示，铅暴露组仔鼠学习和记忆能力下降。提示，胚胎期和发育早期铅暴露可致仔鼠成熟期(生后56 d)学习和记忆功能降低。

1997年，Brakeman首先发现Homer基因[5]。Homer基因依其序列同源可分为3种类型，即Homer 1a、1b、1c，homer 2a、2b，homer3。由366个氨基酸组成的Homer-1b/c，是Homer 1a的剪切异变体，C-末端还有2条长的亮氨酸链，形成螺旋卷曲的二级结构[6]。Homer-1b/c位于突触后，并集中在PSD结构下方，Homer-1b/c在突触边缘含量丰富，与第I组mGluRs(mGluR 1a、1b、1c、1d、1g和mGluR 5a、5b)在突触部位有相似的分布规律[7]。在皮质、海马、纹状体、嗅球和小脑组织中检测到Homer-1b/c，海马内Homer-1b/c主要分布在CA1~CA3区始层(多形层)、辐射分子层及齿状回[8]。本研究结果显示，仔鼠海马中Homer-1b/c基本在生后2周时表达量最高，这与文献[9]报道一致,这一时期是海马的神经元迁移、分化和突触发生并逐渐成熟的时期，这种表达部位和时间的一致性，可能是由于其参与了海马的发育和成熟过程，并对海马的神经环路形成、突触可塑性的维持和学习记忆能力的形成起到潜在作用，因此，Homer蛋白可以作为研究学习记忆行为失常的新指标。

mGluR5在神经系统中参与很多重要生理功能，如介导兴奋性神经信号传导和学习记忆过程中的突触传递[10]。Homer1-b/c蛋白C-末端的卷曲结构相互结合，使谷氨酸受体和细胞内的信号级联放大作用有关的蛋白聚集，形成Homer蛋白二聚体，使mGluRs和3－磷酸肌醇受体(inositol 1,4,5-trisphosphate receptor，IP3R)结合，形成mGluRs-CC-Homer-IP3R大分子复合物[11]，导致胞外Ca2+内流，胞内Ca2+浓度增加[12]，参与长时程增强的发生[13]。Homer1a蛋白受多种因素调节选择性阻断Homer1-b/c的C-末端的卷曲结构与Ⅰ组mGluR相结合破坏多聚复合蛋白体的形成，减少胞内Ca2+释放。mGluR5的C-端结合Homer蛋白则以Ca2+非依赖方式介导主要的细胞外信号调节激酶(extracellularsignal-regulated kinase，ERK)激活[14]。经这条通路激活的ERK可以协同刺激转录因子(transformation specific,ETS)相似基因1和环磷酸腺苷反应成分结合蛋白，从而促进 ETS相似基因1和环磷酸腺苷反应成分结合蛋白敏感基因的表达[15]。环磷酸腺苷反应成分结合蛋白表达是长时记忆的蛋白质基础。

Homer1-b/c的C端和mGluR5的N端相结合，结合其他大分子物质，形成二聚体分子，从而参与调节影响学习记忆的信号通路[6]。Homer1-b/c在mGluR5影响学习记忆的通路中主要起连接和介导的正向调节作用。本研究结果显示，在慢性低浓度铅暴露过程中，仔鼠的脑海马Homer1-b/c的表达量减少。提示，慢性低浓度铅暴露对仔鼠学习记忆能力影响可能与Homer蛋白表达下降，影响mGluR5介导的下游信号通路有关。

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