食品添加剂亚硝酸钠(Na₂NO₂)、亚硫酸钠(Na₂SO₃)长久以来普遍被食品工业广泛用作漂白剂、防腐剂、护色剂、发色剂和抗氧化剂^[1]。亚硝酸盐是一级致癌物，具有血液毒性、神经毒性及免疫毒性^{[2, 3]}。亚硫酸钠可引起呼吸系统、消化系统、神经系统、生殖系统等全身多系统损害^[4-7]。目前大多数研究仅局限于亚硝酸钠或亚硫酸钠单独毒性,中国所使用的食品添加剂卫生学标准也是依据其单一物质的毒性而制定的，然而在很多情况下亚硝酸钠与亚硫酸钠是联合使用的，存在毒性协同或拮抗的可能性。因此，本研究以正常肝细胞株L-02为研究对象，通过观察肝脏常规生化指标及其氧化损伤指标，探讨亚硫酸钠与亚硝酸钠联合作用对肝细胞功能影响，为人群亚硫酸钠及亚硝酸钠联合毒性干预提供依据。

L-02肝细胞(中国科学院典型培养物保藏中心昆明细胞库)，亚硝酸钠、亚硫酸钠(纯度99.5%，美国Sigma公司)，乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)、丙二醛(malondialdelyde,MDA)试剂盒(南京建成科技有限公司)；杜尔伯科极限必需培养基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM)(北京驰明生物科技有限公司)；DnJ-4249 CO₂培养箱(美国 REVCO公司)，DMI 3000B倒置显微镜(德国 LEICA公司)，MK3酶标仪(美国 Thermo公司)，HN96-Ⅱ超声波细胞破碎仪(上海汉诺仪器有限公司)。

将L-02肝细胞用含10%胎牛血清的DMEM于5% CO₂，37 ℃条件培养，隔天换液用0.5%胰蛋白酶消化，隔代培养。处于对数生长期L-02细胞用于试验；采取3×3析因设计：对照组、低、高亚硝酸钠组(2.5、10.0 mmol/L Na₂NO₂)，低、高亚硫酸钠组(5.0、10.0 mmol/LNa₂SO₃)，低N低S组(2.5 mmol/L Na₂NO₂+5.0 mmol/L Na₂SO₃)、低N高S组(2.5 mmol/L Na₂NO₂+10.0 mmol/L Na₂SO₃)、高N低S组(10.0 mmol/L Na₂NO₂+5.0 mmol/L Na₂SO₃)、高N高S组(10.0 mmol/L Na₂NO₂+10.0 mmol/L Na₂SO₃),每组设立6个平行样，置于5% CO₂，37 ℃ 培养箱继续培养24 h。

采用噻唑蓝法[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT]，染毒结束后，每孔加MTT溶液(5 mg/mL)10 μL,37 ℃继续孵育4 h，小心吸弃孔内培养液，每孔加入150 μL二甲基亚砜,振荡15 min,使结晶物充分溶解，采用酶标仪于490 nm波长处测定吸光度(A)值，并计算细胞存活率[细胞存活率=(实验组A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值)。

染毒结束后，1 000 r/min离心5 min,4 ℃收集细胞培养液，酶联免疫吸附法测定LDH、ALT、AST活性,并加入磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)制成细胞悬液，1 000 r/min离心5 min,4 ℃离心收集细胞，超声波裂解细胞，酶联免疫吸附法测定SOD、GSH及MDA含量；严格按照试剂盒说明书操作。

实验数据以表示，应用 SPSS 18.0软件进行统计分析，采用方差分析进行组间比较及交互效应分析，检验水准为α=0.05。

对照组、低、高亚硝酸钠组、低、高亚硫酸钠组、低N低S组、低N高S组、高N低S组、高N高S组L-02细胞存活率分别为(1.00±0.00)%、(1.10±0.10)%、(0.61±0.12)%、(0.59±0.12)%、(0.27±0.11)%、(0.81±0.09)%、(0.69±0.12)%、(0.38±0.11)%、(0.13±0.04)%。随着Na₂NO₂、Na₂SO₃剂量增加，L-02肝细胞存活率逐渐降低(P < 0.01)。

表 1

表 1 Na2NO2、Na2SO3对L-02肝细胞培养液中LDH、ALT、AST水平影响(U/gport，x±s, n=6) 组别 剂量(mmol/L) LDH ALT AST Na2NO2 Na2SO3 对照组 742.30±31.09 3.99±0.08 3.83±0.91 低亚硝酸钠组 2.5 736.27±16.55 3.92±0.14 3.45±0.32 高亚硝酸钠组 10.0 1 735.22±106.63ab 16.05±1.55ab 14.75±1.79ab 低亚硫酸钠组 5.0 1 227.20±22.90abc 5.68±0.06abc 12.08±1.13abc 高亚硫酸钠组 10.0 1 705.33±169.01abd 11.74±1.79abd 14.75±1.79abd 低N低S组 2.5 5.0 1 210.00±385.70abce 4.75±0.94abce 8.95±1.16abce 低N高S组 2.5 10.0 1 605.00±192.29abdf 7.61±3.08abdf 11.38±1.78abf 高N低S组 10.0 5.0 2 026.50±134.79abcdefg 17.76±1.35abdefg 20.33±2.29abcdefg 高N高S组 10.0 10.0 2 327.00±127.03abcdefgh 20.50±2.30abcdefgh 24.18±1.57abcdefgh 注：与对照组比较，a P < 0.01；与低亚硝酸钠组比较，b P < 0.01；与高亚硝酸钠组比较，c P < 0.01；与低亚硫酸钠组比较，d P < 0.01；与高亚硫酸钠组比较，e P < 0.01；与低N低S组比较，f P < 0.01；与低N高S组比较，g P < 0.01；与高N低S组比较，h P < 0.01。

表 1 Na2NO2、Na2SO3对L-02肝细胞培养液中LDH、ALT、AST水平影响(U/gport，x±s, n=6)

随着Na₂NO₂剂量增加，L-02细胞培养液中LDH、ALT、AST水平逐渐升高，差异有统计学意义(P < 0.01)；随着Na₂SO₃剂量增加，L-02细胞培养液中LDH、ALT、AST水平逐渐升高，差异有统计学意义(P < 0.01)。

表 2

表 2 Na2NO2、Na2SO3对L-02肝细胞中SOD、GSH、MDA水平影响(U/gport，x±s, n=6) 组别 剂量(mmol/L) SOD GSH MDA Na2NO2 Na2SO3 对照组 52.33±6.40 75.61±6.95 9.67±0.77 低亚硝酸钠组 2.5 53.87±1.52 76.51±2.41 8.65±4.59 高亚硝酸钠组 10.0 15.87±1.52ab 26.51±2.41ab 37.67±3.26ab 低亚硫酸钠组 5.0 20.23±1.57abc 32.90±2.24abc 54.22±4.08abc 高亚硫酸钠组 10.0 9.37±1.71abcd 14.05±2.56abcd 133.97±17.06abcd 低N低S组 2.5 5.0 36.98±4.11abce 48.15±6.74abcde 32.37±6.92abde 低N高S组 2.5 10.0 31.43±4.33abcdf 43.99±6.19abcdef 94.22±11.58abcdef 高N低S组 10.0 5.0 12.04±2.08abcdefg 23.41±4.07abdefg 82.93±10.75abcdefg 高N高S组 10.0 10.0 6.80±1.65abcdefgh 9.07±1.55abcdefgh 193.85±19.64abcdefgh 注：与对照组比较，a P < 0.01；与低亚硝酸钠组比较，b P < 0.01；与高亚硝酸钠组比较，c P < 0.01；与低亚硫酸钠组比较，d P < 0.01；与高亚硫酸钠组比较，e P < 0.01；与低N低S组比较，f P < 0.01；与低N高S组比较，g P < 0.01；与高N低S组比较，h P < 0.01。

表 2 Na2NO2、Na2SO3对L-02肝细胞中SOD、GSH、MDA水平影响(U/gport，x±s, n=6)

随着Na₂NO₂剂量增加，L-02细胞中SOD、GSH水平逐渐降低(P < 0.01)；随着Na₂SO₃剂量增加，L-02细胞中SOD、GSH水平逐渐降低(P < 0.01)。

表 3

表 3 Na2NO2、Na2SO3对LDH、ALT、AST、SOD、GSH、MDA交互作用分析 指标 统计量 Na2NO2单独作用 Na2SO3单独作用 Na2NO2＼Na2SO3联合作用 LDH F值 71.870 51.820 1.928 P值 0.001 0.001 0.117 ALT F值 88.720 14.390 3.955 P值 0.000 0.015 0.007 AST F值 133.500 78.710 2.283 P值 0.000 0.001 0.075 SOD F值 7.655 5.848 2.273 P值 0.031 0.037 0.053 GSH F值 6.305 6.702 2.283 P值 0.048 0.033 0.45 MDA F值 8.205 34.823 17.402 P值 0.038 0.003 0.019

表 3 Na2NO2、Na2SO3对LDH、ALT、AST、SOD、GSH、MDA交互作用分析

结果显示，Na₂NO₂、Na₂SO₃单独作用时均可影响L-02细胞培养液中LDH、ALT、AST水平及细胞中SOD、GSH、MDA含量(P < 0.05)；但Na₂NO₂、Na₂SO₃对ALT、MDA的交互作用明显(P < 0.05)，对LDH、AST、SOD、GSH交互作用不明显(P>0.05)；Na₂NO₂、Na₂SO₃联合作用对L-02细胞培养液中ALT水平影响表现为拮抗作用，对L-02细胞内MDA含量影响表现为协同、拮抗作用。

AST主要存在于肝细胞线粒体内，AST升高意味着细胞发生了严重的氧化应激反应。LDH在肝组织中酶活力约为血清的1 000倍，体外实验常通过观察培养上清中LDH活性改变推测毒物对细胞膜或细胞活性影响^［8]。SOD、GSH水平下降时,机体对氧自由基的清除能力降低,可导致机体出现严重的脂质过氧化反应^{[9, 10]}。本研究结果显示，随着Na₂NO₂、Na₂SO₃剂量增加，L-02细胞培养液中LDH、ALT、AST水平逐渐升高。提示，Na₂NO₂、Na₂SO₃通过破坏肝细胞膜通透性和诱发氧化应激反应对肝细胞产生了损伤作用。

血清ALT活力与肝细胞坏死程度密切相关，ALT在血液循环中半衰期很短(17 h)^[11]，因此ALT是反映肝病变最为敏感特异的指标之一。MDA是脂质过氧化的分解产物,是反映组织氧化损伤水平的指标^[12]。本研究结果显示，Na₂NO₂、Na₂SO₃暴露与ALT、MDA含量之间存在明显的剂量-效应关系；Na₂NO₂、Na₂SO₃对ALT、MDA的主效应均为正向作用，Na₂NO₂、Na₂SO₃对ALT水平影响的交互作用主要表现为拮抗作用，对MDA含量影响的交互作用主要表现为协同、拮抗作用(高N高S组L-02细胞培养液中ALT水平低于两者单独作用之和，细胞中MDA含量高于两者单独作用之和；高N低S组L-02细胞MDA含量低于两者单独作用之和)。提示ALT、MDA可作为评价Na₂NO₂、Na₂SO₃联合暴露肝损伤交互作用的生物标志物。

本研究结果还表明，2.5 mmol/L亚硝酸钠具有兴奋L-02细胞作用，表现为该剂量下细胞存活率、SOD、GSH水平略微升高，LDH、ALT、AST、MDA水平略微降低。提示亚硝酸钠对L-02细胞具有毒物兴奋效应。毒物兴奋效应是一种非典型的剂量-反应关系，既非阈值模型，也非线性模型，基本形式为U型，主要表现为在低剂量条件下表现为适当的刺激(兴奋)作用，而在高剂量条件下表现为抑制作用(反U型剂量-反应关系)^[13]。可能是机体为抵抗外来刺激，产生的应激调节过程，是一种非特异性反应。近年来研究发现低浓度的亚硝酸盐可以被体内亚硝酸盐还原酶还原为一氧化氮，一氧化氮有刺激细胞增殖和细胞保护作用^[14-16]。

综上所述，Na₂NO₂与Na₂SO₃对肝细胞有联合毒性作用，其机制可能与肝细胞膜损伤和氧化应激有关，Na₂NO₂与Na₂SO₃联合作用对L-02细胞培养液中ALT水平影响表现为拮抗作用，对L-02细胞内MDA含量影响表现为协同、拮抗作用；ALT、MDA可作为Na₂NO₂与Na₂SO₃联合毒性对肝细胞损伤的生物学标志物。