亚硝酸盐，俗称“硝盐”，是一种在工业、建筑业和肉类食品业中广泛应用的无机化合物。亚硝酸盐分子在机体内释放出的NO₂^-，能使血液中正常携氧的低铁血红蛋白氧化成高铁血红蛋白，因失去携氧能力而引起组织缺氧，引起机体中毒，是法医鉴定及预防医学分析中常见的水溶性无机毒物之一^{[1, 2]}。气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)法以其鉴别能力强、分析速度快、灵敏度高等优势，在生物样品分析中占有重要地位。但由于NO₂^-是水溶性无机离子，必须经过前处理使其转换成挥发性较强的物质后再进行GC-MS检测。本研究通过优化NO₂^-与2,3-二氨基萘(2,3-diaminonaphthalene,2,3-DAN)衍生化反应条件，旨在建立快速、准确分析尿液中NO₂^-离子含量的GC-MS方法，结果报告如下。

Shimadzu GC-MS-QP2010(日本岛津公司)，pH测定仪(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；亚硝酸盐标准溶液(中国药品生物制品检定所)，普罗地芬(SKF525A)内标溶液、2,3-DAN(日本和光纯药工业株式会社)。

取0.5 mL尿液，加入pH=3的缓冲溶液1 mL，2,3-DAN 溶液10 μL，涡旋混匀，于60 ℃水浴中加热10 min,冷却后加入内标 5 μL；调pH至8.5，加入乙酸乙酯2 mL，震荡，离心，取上层液体N₂气下浓缩至近干，1 μL进样GC-MS分析。

Rtx-5毛细管柱(聚二甲基硅氧烷)，10 m×0.18 mm×0.2 μm(膜厚)；载气为氦气，柱前压为76.5 kPa，不分流进样；柱初始温度60 ℃，保持1 min，以15 ℃/min上升至270 ℃，保持8 min；EI(70 ev)离子源，离子源温度为200 ℃，接口温度为270 ℃，进样口温度为250 ℃，检测器温度为200 ℃，扫描间隔时间为0.50 s，质量扫描范围为40~900 m/z，扫描时间范围为0~20 min；采用全扫描(Scan)和选择离子检测(SIM)2种方式分析。内标物SKF525A特征离子为：m/z 99和m/z 86；NO₂^-衍生化产物特征离子为：m/z 169,m/z 141和m/z 114。

图 1

图 1 NO2-和2,3-DAN反应机制

反应中，2,3-DAN和NO₂^-发生重氮化反应，进而与另一个氨基分子内缩合成环，生成1H-萘并[2,3-d]^{[1, 2, 3]}三唑^[3]，产物可在National Institute of Standards and Technology(NIST)谱库检索出。

衍生化反应过程中，反应液pH值、温度和反应时间是影响重氮化反应的重要因素。实验中，分别采用pH=2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的缓冲溶液，分别选择20、40、60、80 ℃不同温度下进行衍生化反应，反应时间选择5、10 min，比较不同衍生化反应条件下衍生化产物生成量，以衍生化产物生成量(反应效率)最高的反应条件为最优条件。

分别取10.0、1.0、0.1 μg/mL 3个浓度的标准溶液进行分析。日内精密度：每个浓度的标准溶液平行分析4次，分别计算每种浓度NO₂^-的相对标准偏差(RSD)值；日间精密度：每个浓度的标准溶液配成5份，置于冰箱中冷藏，每天取出1份进行分析，分别计算每种浓度NO₂^-的RSD值。回收率：在尿液中分别加入上述3种浓度的标准溶液，每个样品平行分析4次，计算回收率。

分别将本方法最低检出限、线性范围、相对标准偏差等参数与文献[4]方法(以五氟苄基溴作为衍生化试剂，利用相转移催化剂加速2相之间的反应)比对，确定方法实用性。随机取2份患者尿样，均为干化学检测亚硝酸盐阳性(NIT+阳性)尿液样品，采用2,3-DAN衍生化-GC-MS联用法进行测定，验证方法准确性。

衍生化过程中，重氮盐可以迅速进行分子内缩合成环，形成稳定的衍生化产物。结果显示，反应液pH在2~3之间衍生化产物逐渐增加；pH=3时，衍生化产物量最多；pH>3时，衍生化产物量迅速减少；因此，pH=3为衍生化反应介质的最佳酸碱度。衍生化反应效率随着温度升高而升高，当温度大于60 ℃时，衍生化产物的响应值最高，且趋于平缓；故本方法选择60 ℃作为衍生化最佳温度。衍生化反应5 min后，衍生化产物量明显增加，在10 min后，产量增加趋势平缓；因此，选择10 min作为本方法的最佳衍生化时间。

图 2

注：1：衍生化产物；2：内标；3：2,3-DAN 图 2 尿液中NO2-经2,3-DAN衍生化的总离子流色谱图

图 3

注：1：衍生化产物；2：内标 图 3 尿液中NO2-经2,3-DAN衍生化的选择离子色谱图

尿液中NO₂^-经2,3-DAN衍生化后，色谱图分离度好、灵敏度高、峰形尖锐。内标(SKF525A)保留时间为12.35 min；NO₂^-衍生物的保留时间为11.15 min；剩余的2,3-DAN保留时间为9.32 min。

以标准溶液浓度为横坐标，以subscriber identity module(SIM)色谱图中NO₂^-衍生物m/z 141和内标m/z 86的峰面积之比为纵坐标，绘制标准曲线，线性方程为y=0.207 1x+0.006，相关系数R²=0.999；结果显示，尿溶液中亚硝酸根离子在0.01~20 μg/mL范围内线性关系良好；按照3倍信噪比计算，检测限为0.001 μg/mL。

表 1

表 1 精密度与回收率检测(%) 标准溶液(μg/mL) 日内精密度(%) 日间精密度 回收率(%) 0.10 4.06 5.16 113.50 1.00 3.19 3.92 90.31 10.0 3.31 4.11 102.30

表 1 精密度与回收率检测(%)

结果显示，该方法日内精密度(n=4)为3.19%~4.06%，日间精密度(n=5)为3.92%~5.16%，NO₂^-回收率为90.31%~113.50 %。

表 2

表 2 2,3-DAN衍生化法与五氟苄基溴衍生化法比较 参数 五氟苄基溴衍生化法 2,3-DAN衍生化法 最低检出限(μg/mL) 0.46 0.005 线性范围(μg/mL) 0.92~46 0.05~20 回收率(%) 60 89.43~115.6 精密度(日内) 3.7~8.1 3.43~4.61 耗时(min) 60 30

表 2 2,3-DAN衍生化法与五氟苄基溴衍生化法比较

结果显示，2,3-DAN衍生化-GC-MS联用法检测尿液中NO₂^-含量明显优于五氟苄基溴衍生化法，具有检测限低、精密度高、耗时短等特点。采用2,3-DAN衍生化-GC-MS联用法分别检测2份患者尿液(NIT+阳性)样品结果显示，NIT++、NIT+尿液样品中NO₂^-含量分别为3.629 6、0.691 6 μg/mL。提示，2,3-DAN衍生化-GC-MS联用法与干化学法检测结果具有良好的一致性。

GC-MS具有鉴别能力强、分析速度快和灵敏度高等优势，可完成复杂生物样品中痕量组分的定性和定量分析。但由于GC-MS法不能直接测定NO₂^-含量，故必须对其进行衍生化，转化成易挥发的化合物再进行分析。文献中亚硝酸盐的衍生化方法主要有2种：在酸催化下与芳香族化合物发生硝化反应，衍生化试剂主要有三甲氧基苯，苯，和甲苯^{[5, 6]}；烷基衍生化，衍生化试剂为五氟苄基溴(pentafluorobenzyl bromide,PFB-Br)。使用PFB-Br对NO₂^-进行衍生化，体系在50 ℃下反应1 h，然后用甲苯萃取进行GC/MS或GC/MS/MS分析，实验中发现硝基精氨酸类化合物对测定产生干扰，这些化合物必须经过固相萃取除去^{[7, 8, 9, 10, 11]}。Chen等^[12]通过交换离子进行萃取烷基化，测定人唾液中的NO₂^-，反应近3 h。使用相转移催化剂(tetradecyl dimethyl benzyl ammonium,TDMBA)来加速2相之间的反应，60 ℃水浴中反应30 min，整个操作耗时近1 h^[4]。本研究结果显示，2,3-DAN衍生化法无需相转移催化剂，可直接对尿液中的NO₂^-进行衍生化，操作简便快捷，具有检测限更低、耗时更短、准确度和精密度高等优点。本方法适用于法医鉴定和预防医学分析领域生物样本中亚硝酸盐(NO₂^-)痕量检测。