单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,Lm)是一种革兰阳性无芽孢兼性厌氧杆菌^[1]，对外界环境耐受性较强，可在较高的盐浓度(10% NaCl)、宽泛的pH范围(pH 4.5~9)和温度范围(0~45 ℃)内生长^{[2, 3]}。当人或动物食用被Lm污染的食物后，可能引起以脑膜炎、脑炎、败血症、发热性胃肠炎或流产为症状的李斯特菌病^[4]。李斯特菌病的发病率低，但是死亡率高(25%~30%)，感染的潜伏期通常为7~60 d，因此在溯源上比较困难^{[5, 6, 7]}。多位点序列分型(multi-locus sequence typing，MLST)技术基于管家基因的测序分析，分辨率高、重复性好，便于不同实验室间的数据比较，并可基于MLST网站进行世界范围内的比对，有利于进行全球范围内的分子流行病调查，对病原菌的溯源分析有重要意义。本研究采用MLST对分离自食品的69株Lm进行分型研究，了解河北省的主要基因序列型(sequence type，ST)，为Lm分子流行病学研究提供资料。

本研究检测的69株食源性Lm，均于2010—2012年间分离自生禽肉、生畜肉、水产品、速冻米面制品及凉拌色拉，均经API Listeria试剂条确认。其中30株Lm分离株由石家庄市疾病预防控制中心检出，其余39株Lm由河北省疾病预防控制中心馈赠。

9700型PCR仪(美国ABI公司)，QIAXCEL全自动毛细管电泳仪(美国QIAGEN公司)，PCR扩增试剂盒(美国Promega公司GoTaq^® Colorless Master Mix，批号00000390447)。

将菌株接种血平板37 ℃培养24 h，挑取纯培养的菌落至400 μL TE缓冲液(pH 8.0)中，震荡混匀，煮沸10 min，-20 ℃保存备用。

7个管家基因(abcZ、bglA、cat、dapE、dat、ldh、lhkA)的引物序列参考http://www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/mlst/primers_Lmono.html网站，由大连TAKARA公司合成。PCR体系：2×Gotaq^® Colorless Master Mix 25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，DNA模板2 μL，加水补足体积至50 μL。PCR条件95 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s(bglA基因扩增的退火温度为45 ℃)，72 ℃ 2 min，35个循环；72 ℃ 10 min。扩增片段分别为537、399、486、462、471、453和480 bp 扩增产物经全自动毛细管电泳仪检测后，委托上海生工生物工程有限公司进行双向测序。

测序后的序列采用Sequencer软件进行比对拼接，截取目的片段，将7个管家基因序列上传至http://www.pasteur.fr/cgi-bin/genopole/PF8/mlstdbnet.pl?file=Lmono_isolates.xml网站获得每个序列的等位基因编号，以及对应菌株的ST型。利用Start2软件计算序列的G/C含量、非同义突变/同义突变(dN/dS)的比值、多态位点数。采用BURST对16个ST型进行亲缘分析，利用在线软件绘制SplitsTree进化树。采用辛普森指数(Simposons index of diversity,DI)^[8]作为计算分辨力的方法。

表 1

表 1 7个管家基因核酸序列分析 基因 扩增片段(bp) 等位基因数(个) 多态位点数(%) G/C(%) dN/dS DI(%) abcZ 537 10 5.8 37.51 0.013 1 86.31 bglA 399 9 4.3 40.53 0.002 6 77.06 cat 486 11 6.4 41.14 0.040 0 85.37 dapE 462 10 8.0 42.95 0.064 7 88.62 dat 471 5 12.1 36.48 0.046 2 77.54 ldh 453 10 6.8 43.44 0.012 6 82.52 lhkA 480 7 3.8 37.11 0.034 9 72.12

表 1 7个管家基因核酸序列分析

各管家基因的等位基因数分布于5~11之间，其中dat基因的等位基因数最少(5个)，而cat基因的等位基因数最多(11个)。多肽位点数目最多的基因为dat基因，占序列长度的12.1%，lhkA基因的多态性位点数最少，占序列长度的3.8%；7个管家基因的G/C含量分布于36.48%~43.44%，dN/dS值分布于0.002 6~0.064 7之间。

表 2

表 2 69株Lm的MLST分析结果 ST型 等位基因型 菌株数目 克隆群 CC abcZ bglA cat dapE dat ldh lhkA ST1 3 1 1 1 3 1 3 6 Singleton CC1 ST2 1 1 11 11 2 1 5 7 Singleton CC2 ST3 4 4 4 3 2 1 5 6 Singleton CC3 ST5 2 1 11 3 3 1 7 1 Singleton CC5 ST7 5 8 5 7 6 2 1 1 Singleton CC7 ST8 5 6 2 9 5 3 1 14 Singleton CC8 ST9 6 5 6 4 1 4 1 6 Group9 CC9 ST14 8 6 13 6 5 2 1 1 Singleton CC11 ST87 12 1 4 14 3 39 4 12 Singleton CC30 ST101 7 15 15 8 6 14 9 3 Singleton CC20 ST121 7 6 8 8 6 37 1 3 Singleton CC28 ST122 6 5 6 4 1 62 1 1 Group9 CC9 ST155 7 10 16 7 5 2 1 3 Group155 CC38 ST330 34 39 11 60 3 1 2 1 Singleton CC50 ST378 7 49 19 6 1 24 1 1 Singleton CC13 ST705 7 10 16 7 5 259 1 3 Group155 CC38

表 2 69株Lm的MLST分析结果

本研究对河北地区的69 株分离自食品的Lm进行了MLST分型，通过对7个管家基因目的序列的扩增和测序比对，可将69株Lm分为16个ST型。7个基因的DI值介于72.12%~88.62%之间，将7个基因核酸序列整合后的DI值为89.98%。本研究确定了16个ST型，其中有3株Lm的ldh基因核酸序列经网站管理员(listeriaMLST@pasteur.fr)确认为新的等位基因型259，并确定了该3株菌的基因型为新型ST705 型(7-10-16-7-5-259-1)。在16种ST型中，ST8和ST87所占比例较高(ST8为14/69，ST87为12/69)，其次为ST2(7/69)、ST1(6/69)、ST3(6/69)和ST9(6/69)，其余各菌株的ST型出现较少，仅有3株或1株菌。采用BURST对16个ST型进行亲缘分析，ST155和ST705属于克隆群155(Group 155)，ST9和ST122属于克隆群9(Group 9)；其余ST型均为独特型(singleton)。而结合网站(http://pubmlst.org/data/profiles/lmonocytogenes.txt)上已公布的649个ST型进行亲缘分析，16个ST型被划分为14个克隆复合物(Clonal complexes CC)。

图 1

图 1 16种ST型的Splits Tree分析结果

利用Splits Tree建立的进化树分析菌株的亲缘相关性。ST155和ST705亲缘关系较近，ST9和ST122的亲缘关系较近，分别属于克隆群155和克隆群9。ST1和ST5，ST2和ST3，ST5和ST330，ST8和ST14，ST101和ST121这5组数据，每组均有3个相同的等位基因，具有较近的亲缘关系。

2010—2012年不同年份检出的Lm的主要ST型不同，2010年的14株Lm的主要ST型为ST9(4/14)和ST87(4/14)；2011年的42株Lm 的主要ST型为ST8(12/42)、ST2(7/42)、ST1(6/42)和ST87(6/42)；2012年13株Lm的主要ST型为ST3(6/13)和ST101(3/13)。同一种ST型在不同年份间分布亦存在差异。一些ST型集中出现在某一年，如ST1和ST2仅见于2011年；ST3仅出现于2012年，且占2012年检出菌株总数的46.15%；14株ST8型菌株,仅2011年就占12株，其余2株见于2010年。还有一些ST型，如ST9和ST87则普遍分布于2010—2012年3年中。

不同ST型在河北省不同地区的分布有差异，如ST1仅见于石家庄市，ST2仅见于沧州市，6株ST3秦皇岛占5株，而ST8、ST9和ST87却主要集中于秦皇岛市、承德市和石家庄市。不同ST型在不同城市所占比重不同，承德市仅有的7株Lm分离株均为ST8型，石家庄市的主要ST型为ST87和ST1，沧州主要ST型为ST2。同一ST型的地理分布还存在不同,ST8、ST87和ST121这3个ST型的Lm菌株分布范围较广，如ST8在承德市、张家口市、廊坊市、石家庄市和邯郸市均有分布；ST87则在秦皇岛市、保定市、石家庄市和邯郸市有分布；ST121在张家口市、廊坊市、石家庄市有分布。

目前虽然有较多的分型方法可应用于食源性病原菌分型，但是传统分型方法，如血清型分型、噬菌体分型、多位点酶电泳分型等分型方法分辨力有限，检测结果易受操作人员经验等外界条件影响，尤其在突发公共卫生事件需进行流行病学调查和溯源时，很难满足准确、快速溯源的需要。随着分子生物学的发展，目前已有多种分子分型方法(如脉冲场凝胶电泳、扩增片段长度多态性、随机扩增多态性DNA等)可供选择，虽然这些方法具有较高的分辨力，但是它对仪器、试剂的要求较高，且需要专业的操作技能，实验室间结果差异较大，较难实现资源共享，目前还不能作为一种标准化的方法来应用^{[9, 10]}。MLST选取一组管家基因作为研究对象，序列比较保守，在漫长的进化过程中能够保持一定的稳定性，能更好的表现不同菌株间的系统发育关系，因此，MLST是进行微生物流行病学调查的有力工具^{[11, 12]}。本研究采用MLST方法对河北地区分离的69 株Lm进行分型检测，得到16个ST 型，DI值为89.98%，分辨力较高，可满足实验室对李斯特菌病溯源检测以及常规对Lm分子分型监测，从而建立分子流行病学数据库的需求。Wang等^[13]在其研究中指出中国比较常见的ST型有ST9、ST8和ST87，而本研究发现河北省优势ST型为ST8、ST87、ST2、ST1、ST3和ST9，占全部菌株的73.9%，提示河北省优势的ST型相对较多，各ST型分布较分散，遗传具有多样性，这也与本地区的独特型Lm菌株占大多数相符合。本研究新发现的ST705与ST155具有较近的亲缘关系，形成了同一个克隆群CC38，提示ST705菌株可能由ST155菌株进化而来。在对网站全部649个ST型的分析可见，本研究的16个ST型分别属于14个CC，其中属于CC8、CC30、CC2、CC1、CC3、CC9的菌株占全部菌株的73.9%。有文献指出CC1和CC2分离株中，来源于病人的比率是来源于食品的2.60:1与2.77:1，强调该2种CC与临床致病菌关系较为密切^[14]，而本研究中发现的CC1和CC2的菌株有13株，占18.8%，比例相对较高。另外Wang等^[13]在其研究中指出ST1、ST2、ST3、ST5、ST6、ST8和ST9是能够引起新生儿感染或暴发的ST型，对此开展监测，可以为预防李斯特菌病提供重要信息。通过分析pf8-bioinfo@pasteur.frpf8-bioinfo@pasteur.fr网站www.pasteur.fr/mls的Lm MLST数据库发现，在国际上引起暴发的ST型别主要有ST1(1989年法国和1995年瑞典)、ST63(1992年法国)、ST67(1993年法国)和ST4(1995年和2000年法国)；对动物和人致病的ST型别有ST2、ST7、ST19、ST63、ST101、ST340、ST353和ST354。由此可见，引起人和动物致病的Lm的ST型别较多，在河北地区有可引起李斯特菌病的ST型存在。Lm在食品中的分离率较高^[15]，在国外Lm已成为除沙门氏菌和弯曲杆菌外的一种主要的食源性致病菌^[16]，而中国目前临床对李斯特菌病的诊断病例较少，除一方面中国特有的吃熟食的饮食习惯外，也与临床工作中对此病的重视程度不够有关。本研究结果提示临床工作者应提高对李斯特菌病的关注度，开展相关的临床检测工作。同时本研究还发现，虽然本研究所采用的菌株数目较少，但已能明显显示出Lm的优势ST型在不同时间和不同地区分布特点不同，提示各地区均应加强本地区Lm的长期分子流行病学监测，从而揭示Lm的流行规律和特点，为今后进行暴发疫情的流行病学调查和溯源提供基础资料。