中国公共卫生  2016, Vol. 32 Issue (3): 321-324   PDF    
引用本文
唐小敏, 朱青, 张丽, 任刚, 叶绪芳, 吴升伟, 戴丽芳. 贵州省B3基因型麻疹病毒分子特征[J]. 中国公共卫生, 2016, 32(3): 321-324.
TANG Xiao-min, ZHU Qing, ZHANG Li, et al. Molecular characterization of measles virus of genotype B3 isolated in Guizhou province[J]. Chinese Journal of Public Health, 2016, 32(3): 321-324.
贵州省B3基因型麻疹病毒分子特征
唐小敏, 朱青, 张丽, 任刚, 叶绪芳, 吴升伟, 戴丽芳     
贵州省疾病预防控制中心免疫规划所, 贵州 贵阳 550004
收稿日期: 2014-09-01; 数字出版日期: 2015-4-30 14:13
作者简介: 唐小敏(1975-),男,贵州遵义人,副主任技师,本科,研究方向:麻疹、风疹病毒实验室检测。
摘要: 目的 分析贵州省2014年首次发现B3基因型麻疹病毒分子特征。方法 采集咽拭子经实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(real-time RT-PCR)筛查麻疹病毒核酸。用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增麻疹病毒核酸筛查阳性咽拭子,对麻疹病毒N基因羧基末端634个核苷酸片段进行扩增,对扩增产物进行序列测定和分析,构建基因亲缘性关系树。结果 Guizhou14-06(MVs/Guizhou.CHN/11.14/01)在亲缘关系上与WHO B3基因型参考株MVi/Ibadan.NGA/0.97/1(AJ232203)同属一个分支,与MVi/Ibadan.NGA/0.97/1(AJ232203)的核苷酸和氨基酸差异分别为2.00%和2.67%;与中国目前的优势流行参考株MVi/Hunan.CHN/0.93/7(AF045212)的核苷酸和氨基酸差异分别为10.8%和12.0%;与其他WHO 22个基因型参考株的核苷酸和氨基酸差异分别为4.40%~11.0%和4.67%~12.0%。结论 B3基因型麻疹病毒是贵州省首次发现的新基因型麻疹病毒,丰富贵州省麻疹病毒分子流行病学基线数据,并有助于麻疹病毒的控制和消除工作。
关键词: 麻疹病毒     B3基因型     序列分析     贵州    
Molecular characterization of measles virus of genotype B3 isolated in Guizhou province
TANG Xiao-min, ZHU Qing, ZHANG Li, et al     
Department of Immunization Programs, Guizhou Provincial Center for Disease Control and Prevention, Guiyang, Guizhou Province 550004, China
Abstract: Objective To analyze the molecular characteristics of measles virus of genotype B3 isolated firstly in Guizhou province in 2014.Methods Throat swab specimens were collected from patients with clinically diagnosed measles and tested for viral RNA using real-time reverse transcription-polymerase chain reaction(real-time RT-PCR) after RNA extraction.Fragments of 634 nucleotides of the carboxyl end of nucleoprotein gene were amplified by using reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) and then the PCR products were directly sequenced and analyzed.The phylogenetic analysis was based on the 450 bp C-terminal end of the N gene sequences.Results The isolated virus strain, named MVs/Guizhou.CHN/11.14/01, was clustered within the same genotype group with World Health Organization(WHO) genotype B3 reference strain, Ibadan.NGA/0.97/1(AJ232203).The nucleotide and amino acid divergence were 2.00% and 2.67% compared with Ibadan.NGA/0.97/1(AJ232203).Compared with WHO H1 genotype reference strain(MVi/Hunan.CHN/0.93/7), the nucleotide and amino acid divergence were 10.8% and 12.0%, respectively.The evolutionary distance of nucleotide and amino acid of the B3 genotype and the representative WHO 22 genotype strains were between 4.40%-11.0% and 4.67%-12.0%.Conclusion A new genotype B3 measles virus was isolated in Guizhou province in 2014 and the identification of the virus strain is helpful to control and eliminate measles epidemic in Guizhou province.
Key words: measles virus     B3 genotype     sequence analysis     Guizhou province    

麻疹是一种传染性很强的呼吸道传染病，可引起急性发热出疹性疾病，主要通过呼吸道飞沫或直接接触感染者的鼻或咽喉分泌物而传播，严重危害儿童健康[1]。随着麻疹减毒活疫苗(measles attinuated live vaccine,MV)的广泛应用，麻疹的发病得到了有效的控制，但要消除和控制麻疹，仍面临着众多的挑战[2]。麻疹病毒属于副粘病毒科麻疹病毒属，是单一血清型病毒。世界卫生组织根据病毒核蛋白基因和血凝素蛋白基因的核苷酸序列差异[3]，目前将麻疹病毒分为8个基因组共24个基因型(A,B1-B3,C1,C2,D1-D11,E,F,G1-G3,H1,H2)[4]。2014年贵州省疾病预防控制中心麻疹实验室针对1例麻疹疑似病例进行特异目的基因扩增与基因序列分析，结合流行病学调查及贵州省麻疹病毒学监测资料，证实为B3基因型麻疹病毒。本研究对B3基因型麻疹病毒进行分子特征分析。现将结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 标本来源、采集及运送

标本来源于黔西南州兴义市人民医院就诊的疑似麻疹病例，该病例于2014年3月15日出现身体不适，3月16日出现发热、出疹，3月18—19日当地疾病预防控制中心专业技术人员分别采集了静脉血和咽拭子。血标本经常温下1 500 r/min，离心20 min，分离血清，并分装于血清螺旋管中，及时冷藏送检并保存于-20 ℃备用。采集的咽拭子标本置于2 mL标本运输液中(含2%牛血清、青霉素1 000 U/ml和链霉素1 000 U/mL的细胞培养液)，冷藏送检及-70 ℃以下温度保存备用。

1.2 主要试剂与仪器

麻疹病毒核酸检测试剂盒(江苏硕世生物科技有限公司)，酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)麻疹病毒IgM抗体检测试剂盒(珠海海泰生物制药有限公司)，DMEM培养基(日本制药株式会社)，QIAamp Viral RNA Mini Kit(德国QIAGEN公司)，One Step RT-PCR Kit Ver.2(Dye Plus)[宝生物工程(大连)有限公司]，MK3型酶标仪[热电(上海)仪器有限公司]，7500 PCR仪(美国ABI公司)，基因扩增仪(杭州博日科技有限公司)，凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司)，ABI 3100测序仪(美国Life公司)。

1.3 方法 1.3.1 麻疹病毒核酸快速筛查与抗体检测

用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(real-time reverse transcription-polymerase chain reaction,real-time RT-PCR)从咽拭子中筛查麻疹病毒核酸(由黔西南州疾病预防控制中心麻疹实验室完成检测)，阳性咽拭子标本均在24 h内冷藏运送到贵州省疾病预防控制中心麻疹实验室进行检测。用ELISA捕获法进行麻疹IgM抗体检测(由黔西南州疾病预防控制中心麻疹实验室完成检测，贵州省疾病预防控制中心麻疹实验室进行复核)。

1.3.2 特异目的基因扩增

用核酸提取试剂(具体操作参照说明书)，直接从筛查阳性临床咽拭子标本中提取病毒RNA扩增特意目的基因。使用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)，对核蛋白(nucleoprotein,N)基因C(碳)末端的634个核苷酸片段进行扩增，引物片段参照相关文献(阳性对照略大于麻疹核酸扩增片段，由美国疾病预防控制中心提供)[5]，其上游引物为MeV216(5′-TGG AGC TAT GCC ATG GGA GT-3′)，下游引物为MeV214(5′-TAA CAA TGA TGG AGG GTA GG-3′)。反应条件为50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min。94 ℃ 30s，55 ℃ 30s，72 ℃ 1 min，30个循环。72 ℃延伸10 min，扩增后产物经琼脂凝胶电泳鉴定。

1.3.3 序列测定与分析

扩增后的PCR产物送中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家麻疹实验室进行复核与测序。从GenBank调出参照的麻疹病毒代表株基因序列资料、MV沪191(Shanghai,S191)，使用Bio Edit 7.0[6]软件进行多序列比对，用MEGA 6.0[7]软件采用NJ(Neighbor-joining)法(Bootstraps=1 000)对鉴定出的麻疹病毒株与参考株N基因羧基末端450个核苷酸序列进行分子遗传特征和基因亲缘关系分析。同时把用NCBI(National Center for Biotechnology Information,http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)BLAST比对分析的当前流行的B3基因型麻疹病毒株也作为参考。

2 结 果 2.1 病例基本情况

该患者为女性，籍贯为黔西南州兴仁县，初中学生，2001年10月20日出生；患者曾于2014年2月27日从黔西南州兴仁县乘车到浙江省象山县医院照顾因煤气中毒生病的母亲，并于3月7日晚乘车返回兴仁县家中，于3月15日感到身体不适，3月16日出现发热、皮肤红疹、流鼻血，曾自购口服药(具体药名不详)治疗，未见好转，于3月17日就诊于黔西南州兴义市人民医院，当地医院以“疑似麻疹”病例诊断并上报。采集了患者的咽拭子和血标本。咽拭子标本经real-time RT-PCR检测为麻疹病毒核酸阳性，血清ELISA检测为麻疹病毒IgM抗体阳性。

2.2 麻疹病毒标准命名及鉴定结果

依据WHO标准化命名[3, 4]，将该麻疹病毒Guizhou14-06(实验室编号)命名为：MVs/Guizhou.CHN/11.14/01[B3]。

2.3 麻疹病毒特异目的基因扩增(图 1)
注：M:DL-2 000 DNA Marker；1.阴性对照；2.细胞培养阴性对照；3～4.临床咽拭子标本中未检测到麻疹病毒；5.临床咽拭子标本中检测到麻疹病毒；6.麻疹病毒细胞培养阳性分离物；7.Guizhou14-06(GZ14-06)；8.阳性对照。 图 1 麻疹病毒RT-PCR扩增产物电泳图

直接从临床咽拭子标本中提取病毒RNA进行扩增，扩增N基因COOH末端的634个核苷酸片段，将RT-PCR扩增产物经1.7%的琼脂糖凝胶电泳见目的片段条带。

2.4 麻疹病毒基因亲缘性关系和分子特征分析(图 2)
注：△ Guizhou14-06(GZ14-06)麻疹病毒；▲ WHO麻疹病毒B3基因型参考株；● 当前B3基因型麻疹病毒流行株。 图 2 2014年Guizhou14-06麻疹病毒(MVs/Guizhou.CHN/11.14/01)，基于编码N蛋白羧基未端的450个核苷酸序列与WHO 24个麻疹基因型参考株，中国麻疹疫苗株以及当前流行于其他国家B3基因型麻疹病毒株序列的亲缘关系树

将Guizhou14-06麻疹病毒的N蛋白羧基末端450个核苷酸片段序列与24个WHO基因型参考株，MV沪191(S191)及与BLAST比对分析的当前流行的B3基因型麻疹病毒株:MVs/CapeTown.ZAF/33.10(KC305689.1)，MVs/CapeTown.ZAF/34.10(KC305687.1)，MVs/Muenchen.DEU/06.14(KJ767565.1)，Mvs/Aichi.JPN/4.14/2(AB914703.1)，Mvs/Aichi.JPN/(AB914702.1)，构建基因亲缘性关系树。结果显示，Guizhou14-06(MVs/Guizhou.CHN/11.14/01)在亲缘关系上与WHO B3基因型参考株MVi/Ibadan.NGA/0.97/1和MVi/New York.USA/0.94同属一个大分支，但与MVi/Ibadan.NGA/0.97/1更为接近(bootstrap值为98%)。Guizhou14-06与当前B3基因型麻疹流行株：MVs/CapeTown.ZAF/33.10，MVs/CapeTown.ZAF/34.10,MVs/Muenchen.DEU/06.14,Mvs/Aichi.JPN/4.14/2,Mvs/Aichi.JPN/4.14/1在亲缘关系上同聚于一个分支(bootstrap值为99%)，经BLAST比对分析相似性为99%～100%。

Guizhou14-06与WHO基因型参考株之间N蛋白羧基末端序列核苷酸和氨基酸进行遗传差异比较，与MVi/Ibadan.NGA/0.97/1(AJ232203)的核苷酸和氨基酸差异分别为2.00%和2.67%；与MVi/New York.USA/0.94(L46753)的核苷酸和氨基酸差异分别为3.20%和4.67%；与中国目前的优势流行参考株MVi/Hunan.CHN/0.93/7(AF045212)的核苷酸和氨基酸差异分别为10.8%和12.0%；与其他WHO 22个基因型参考的核苷酸和氨基酸差异分别为4.40%～11.0%和4.67%～12.0%。上述基因亲缘性关系和分子特征分析显示：Guizhou14-06属于麻疹病毒B3基因型。

3 讨 论

要实现消除麻疹的目标，其中一个重要条件就是无本土麻疹病毒传播，而高敏感性的麻疹病毒分子流行病学监测系统是证实达到麻疹消除不可缺少的技术平台。在麻疹监测系统中，由于血清学检测的局限性，不能明确病毒的来源和传播途径，并区别本土病例和输入性病例以及疫苗相关病例，所以通过分析病毒的分子特征对疾病的监测和流行病学调查方法进行了补充和完善，对麻疹的控制和消除有着重要意义。WHO规定通过对麻疹病毒编码N蛋白羧基末端的450个核苷酸序列测定,并与WHO参考株的序列做比较，以划分麻疹病毒的基因型别[3, 4]。中国通过对麻疹病毒分子流行病学的系统研究，证实H1基因型是中国麻疹病毒流行的绝对优势本土基因型[8, 9]。但近几年，由于经济的迅速增长，人员交流和流动的频繁，中国部分省(市)相继出现D9、D4、D11、D8等输入性基因型麻疹病例[10, 11, 12, 13]，由于麻疹病毒学监测的高灵敏度和及时性，快速鉴别出本土流行株和输入性病毒株，使传播得到了有效的阻断。B3基因型麻疹病毒主要分布在非洲大陆[14, 15]，其他国家也曾有报道，主要从非洲传入[16, 17]。2014年贵州省首次检测到B3基因型麻疹病毒，经NCBI中BLAST比对分析，该B3基因型麻疹病毒与南非、德国、日本等地的B3基因型麻疹病毒高度相似，与2013—2014年相继在上海市和广东省发现的B3基因型麻疹病毒核苷酸和氨基酸相似性约为100%[18]。该病例经流行病学调查发现，患者有明确的外出史，传播链调查显示，2014年2月27日—3月7日，患者在浙江省象山县第一人民医院期间，该医院网站信息显示至春节以来，均有麻疹流行并有确诊病例。由于患者在浙江省象山县的生活情况不清楚以及当地流行的麻疹疫情信息不详，尚不能确定患者感染的病毒来源。贵州省近年检测到的麻疹病毒，经序列分析，证实均为H1基因型[19, 20]；进一步对该B3基因型病例所在居住地和学校进行主动搜索未发现疑似麻疹病例，同时实验室对采集的咽拭子的检测，均未发现麻疹B3基因型，故该B3基因型麻疹病毒为输入性的可能很大。

贵州省是外出务工人员较多的省份，外来输入性基因麻疹病毒在贵州省传播流行的可能性很大，因此，应加强贵州省麻疹病毒学监测，深入了解贵州省麻疹病毒的遗传变异，分析其对传播和流行的影响，为贵州省控制和消除麻疹提供重要的实验室依据。

志谢 本次研究得到了中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所WHO西太平洋区麻疹参比实验室及贵州省黔西南州疾病预防控制中心麻疹实验室的支持与帮助，特此感谢

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