苯并芘[benzo(a)pyrene ，BaP]为多环芳烃的典型代表，是强致癌物之一^[1]。BaP主要来源于煤和石油等有机化合物的热解或不完全燃烧，广泛存在于空气、水、土壤及其他植物产生的烟和食品中^{[2, 3]}。食用受其污染的食品，虽然不一定表现出明显的急性毒性，却具有公认的致畸、致癌慢性毒性^[4]。BaP的检测方法有国家标准(GB/T 5009.27-2003)规定的2种检测方法，分别是荧光分光光度法和目视比色法，但这2种方法存在操作复杂、检测灵敏度较低的缺陷^[5]。目前，高压液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)^{[6, 7]}、液相色谱-荧光法^[8]、气质联用法(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)^{[9, 10]}及液质联用法(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)^[11]等仪器检测法也逐渐开始应用，但普遍存在试验仪器要求较高，检测过程较复杂、耗时、昂贵等局限性，不利于实现BaP的快速、简便和高通量检测。因此，本研究利用BaP全抗原及单抗隆抗体，建立一种灵敏度高、快速、特异性强、操作简便的酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)，并对南昌周边湖泊、养鱼塘及自来水样中BaP进行了检测，结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器

BaP-牛血清白蛋白(bovine serum abumin,BSA)(江西师范大学生命科学学院)^[12]；单克隆抗体(美国Abcam公司)。DG5031酶联免疫检测仪[华东(上海)电子集团医疗装备有限责任公司]。 1.2 单克隆抗体效价测定

采用间接ELISA法，用酶标仪测OD 450值，以不加入抗体的孔为空白对照调零，以其它鼠血清抗体为阴性对照OD 450值为N，抗原及抗BaP反应孔OD 450值为P。若P/N＞2，则此时抗体稀释倍数即为其效价。 1.3 间接竞争ELISA法建立

采用棋盘滴定方法^[13]确定反应的抗原最佳浓度和抗体稀释倍数。抗BaP单抗1B3棋盘滴定条件为：包被抗原分别为0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μg/mL；抗体工作浓度分别为1:1 000，倍比稀释7孔至1:128 000；酶标二抗工作浓度为1:5 000；配制BaP标准溶液，浓度分别为150.0、100.0、50.0、25.0、10.0、5.0、1.0、0.5、0.1 ng/mL；在最佳抗原浓度和抗体最佳稀释倍数条件下，分别进行不同pH值(5、6、7、8、9)、Na⁺离子浓度(0.01、0.10、0.20、0.50、1.00 mol/L)及甲醇浓度(5%、10%、 20%、30%、40%)时ELISA检测；根据标准曲线确定最低检测限、线性范围和半量抑制浓度(IC₅₀值)。 1.4 交叉反应测定

采用上述ELISA间接竞争方法分别检测BaP结构类似物：荧蒽(fluoranthene)、芘(pyrene)、苯并(a)蒽[benzo(a)anthracene]、屈(chrysene)、苯并(b)荧蒽[benzo(b)fluoranthene]、茚并(1,2,3-cd)芘[indeno(1,2,3-cd)pyrene]及苯并[g,h,i]芘[benzo(ghi)perylene]等的交叉反应率，各结构类似物的浓度为0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μg/mL。 1.5 实际水体中BaP检测与加标回收试验

共收集南昌城内4份湖泊水样、周边养鱼塘5份水样及市政自来水样2份，采用上述间接竞争ELISA法检测水样中BaP含量。在阴性样本中分别加入BaP标准品进行加标回收试验，加入标准品浓度分别为20、10、5 ng/mL，每个浓度重复检测3次，计算回收率。 2 结 果 2.1 单克隆抗体效价及最佳抗原、抗体工作浓度

间接ELISA结果显示，单克隆抗体效价达到1：2.5×10⁵；最佳包被抗原浓度为10 μg/mL，抗体最佳稀释倍数为1:5 000。 2.2 反应体系中pH优化(图 1)

以BaP浓度为横坐标，B/B0(B/B0=Bap标准浓度对应的OD值/阴性对照的OD值)为纵坐标制作不同pH条件下的竞争抑制曲线，结果显示，反应体系中 pH 值在 6.0~8.0 时，IC₅₀ (IC₅₀：B/B0等于50%时的Bap浓度)几乎无变化，即灵敏度无明显差异；当缓冲液pH值下降至5.0或升高至 9.0时，IC₅₀值迅速增加，即灵敏度降低。因此，反应体系偏酸或是偏碱均不利于反应进行；缓冲液pH值在7.4 时是免疫竞争反应的较好环境，此时的反应灵敏度最高。

图 1

图 1 反应体系中pH优化

BaP属于疏水性物质，盐离子浓度升高有助于提高其水溶性；但在ELISA体系中，高盐离子有可能影响抗原 和抗体的免疫学反应。当盐离子浓度从0.01 mol/L逐渐加大至0.5 mol/L时，曲线中IC₅₀也逐渐增大，即灵敏度变低，但变化的趋势较为缓慢；当离子强度增大到1 mol/L时，IC₅₀明显增大，即灵敏度明显降低。本方法最终确定盐离子最佳浓度为0.01 mol/L。

图 2

图 2 反应体系中盐离子浓度优化

抗原和抗体的反应一般是在水相中进行，但当小分子抗原的水溶性较差时，需加入一定浓度的有机溶剂助溶，常用的有机溶剂为甲醇，但有机溶剂浓度过高可能影响抗原抗体反应。当甲醇浓度分别为5%、20%、30%、40%时，检测灵敏度均低于10%甲醇缓冲液。提示甲醇浓度过低，不利于BaP溶解；过高，则可能影响检测结果。本方法最终采用10%甲醇缓冲液作为样品溶解液。

图 3

图 3 反应体系中甲醇浓度优化

当Bap浓度在5~50 ng/mL时线性关系良好，其线性方程为：y=-28.105 ln(x)＋123.66，R²=0.993 7；IC₅₀为13.7 ng/mL；抑制率达90%时，BaP最低检测限为3.3 ng/mL。表明本研究所建立的检测方法能达到食品或饮用水中BaP残留检测灵敏度要求。 2.6 单克隆抗体特异性

本研究选择7个与Bap结构相似度较高的多环芳烃物质进行交叉反应实验，结果显示，与茚并(1,2,3-cd)芘、荧蒽、苯并(a)蒽、屈、芘、苯并(b)荧蒽及苯并(g,h,i)芘的交叉反应率分别为67%、45%、39%、37%、36%、25%、16%。 2.7 实际水样检测及加标回收试验(表 1)

采用本研究所建立的间接竞争ELISA法对现场采集的11份水样进行检测，结果显示BaP均未检出。以检测结果为阴性的水样进行BaP加标回收试验，结果显示，回收率为94.8%~112.3%，变异系数为4.38%~9.72%。表明本方法具有较好的准确率和精密度，适用于大批量样品的快速初筛。

表 1

表 1 BaP加标回收率(n=3) 加标量 (ng/mL) 实际检测 值(ng/mL) 回收 率(%) 变异系 数(%) 5 4.74±0.46 94.8 9.72 10 11.23±0.71 112.3 6.33 20 21.58±0.94 107.9 4.38

表 1 BaP加标回收率(n=3)

本研究通过棋盘滴定法确定了抗原和抗BaP抗体的最佳工作浓度，筛选出pH值、盐离子浓度和甲醇浓度最佳条件，建立了检测BaP的间接竞争ELISA方法，BaP最低检测限为3.3 ng/mL，IC₅₀为13.7 ng/mL，线性范围为5~50 ng/mL；特异性试验结果显示，单克隆抗体与7个Bap结构相似度较高的的多环芳烃物质均存在一定程度的交叉反应；加标回收试验结果显示，该方法具有较好的准确率和精密度，可应用于水体中BaP快速筛查。