人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)是引起艾滋病(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)的唯一病原^{[1, 2]}，根据对病毒的全基因序列分析以及艾滋病病毒系统分类标准可以分为HIV-1和HIV-2型,目前流行全球的HIV-1分为M(main) 、O(outlier) 和N(non-M-non-O)3个组^[3]，另有报道将新发现的一组病毒按字母顺序命名为P组^[4]。 M组又可分为A、B、C、D、F、G、H、J和K 9个亚型及61个循环重组型(circulating recombinant form,CRF)^[5](Los Alamos HIV Database，数据截止至2014年6月24日)。本研究对大连地区2008—2012年新确认的HIV-1感染者中流行的CRF 01_AE株Env基因进行序列测定及系统进化分析，了解毒株的可能传播链及遗传变异特征。 1 材料与方法 1.1 标本采集与处理

采用SPSS 19.0对大连市2008—2012年新确证的898例感染者进行单纯随机抽样^[6]，共抽取感染者144例，采集乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA)抗凝全血10 mL 分离血浆并分装用于后续试验和HIV抗体确证(Western blot，WB)(新加坡MP公司免疫印迹试剂盒)实验。 1.2 主要试剂与仪器

QIAGEN RNeasy Mini Kit(德国QIAGEN公司)，扩增引物、Prime Script One Step RT-PCR Kit、Takara EX Taq HS、Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit(均由大连宝生物Takara公司提供)，Sanger法双向测序(大连宝生物Takara公司)。 1.3 病毒核酸提取与扩增

采用QIAGEN RNeasy Mini Kit提取血浆中的病毒RNA，具体操作按照说明书进行。采用巢式PCR(nested-PCR)对HIV病毒Env基因C2-V3区基因片段进行扩增，第1轮扩增使用ED 5、ED 12作为外引物，试剂盒采用Prime Script One Step RT-PCR Kit；第2轮扩增使用Env 7、Env 8作为内引物，目的片段长为666 bp，试剂盒采用 Takara EX Taq HS。引物序列、扩增体系及反应条件见参考文献^{[7, 8]}。 1.4 PCR产物纯化及序列测定

PCR扩增产物经QIAGEN QIAxcel毛细管电泳验证产物片段大小无误后，1%琼脂糖凝胶电泳分离目的片段，用Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit进行切胶回收，Sanger法双向测序。测序引物为第2轮扩增引物。 1.5 序列分析

使用Lasergen 7.1软件包的Editseq程序进行序列校正和裁剪；综合NCBI的亚型分析工具 Genotyping和比对工具Blast对所得序列进行分型。多序列比对使用Clustal X 2.1进行，采用 MEGA 5.05 软件构建 neighor-joining 系统进化树(重复运算500 次)并进行分型验证，使用MEGA 5.05 软件中的Distance程序(碱基替代模型为Kimura-2 parameter model)计算基因进化距离，使用SPSS 19.0对所得数据进行统计学分析,对2组基因遗传距离比较采用t检验，对多组样品的基因遗传距离比较时采用方差分析，不同传播途径的亚型分布采用χ²检验，P<0.05有统计学意义。比对中所选HIV毒株序列均下载于Los Alamos HIV Database。 2 结果 2.1 一般情况

采集的144份标本经核酸提取、2轮扩增后对其Env片段进行序列测定。测序成功标本103份，其Env基因序列通过Genotyping、Blast分析和系统进化树验证，大连市2008—2012年新确证HIV感染者中CRF 01-AE 重组型占62.14%(64/103)。64例研究对象中男性感染者占89.06%(57/64)，女性感染者占10.94%(7/64)，男女比例为8.14:1；年龄分布22~70岁，平均年龄36.89岁；未婚53.12%(34/64)，已婚28.13%(18/64)，离异或丧偶18.75%(12/64)；本科/大专及以上学历占44.66%(30/64)，高中/中专及以下学历占55.34%(34/64)；性传播途径感染占96.87%(62/64)，其中同性性接触传播占64.06%(41/64)，异性性接触传播占32.81%(21/64)，静脉注射吸毒及传播途径不详各占1.56%(1/64)；户籍所在地为大连的病例占68.75%(44/64)，东3省(除大连)占29.69%(19/64)，其他省份占1.56%(1/64)，其中东3省(除大连)的病例中，辽宁占12.5%(8/64)，黑龙江占10.93%(7/64)，吉林占6.25%(4/64)。 2.2 大连地区CRF 01_AE株与各亚型参考株Env基因系统进化树分析(图 1)

选取CRF 01_AE亚型序列中覆盖Env C2-V3区域且测序无杂合的部分研究对象，与各亚型标准毒株Env序列共同构建系统进化树，验证分型并计算基因离散率。大连市CRF 01-AE重组株与泰国参考株01_AE.TH.90.CM240和中国参考株01_AE.CN.05.05GX001系统进化树上位于同一分支，毒株与泰国株CM240的基因离散率为(9.0±1.6)%，与中国株05GX001的基因离散率为(12.8±2.0)%，组内平均基因离散率为(11.8±1.9)%；系统进化树显示大连市CRF 01-AE重组株进化簇中存在2个亚簇，第1亚簇内异性传播所占比例为66.7%，将该亚簇命名为 Hetero簇。第2亚簇内同性传播所占比例为70.0%，将该亚簇命名为MSM簇。χ²检验2亚簇内同性或异性传播有统计学差异(P<0.05)。应用Entropy软件分析MSM簇和Hetero簇毒株的核苷酸多态性差异，以MSM簇序列为参照，Hetero簇相对于MSM簇核苷酸多态性增加的位点为160个，核苷酸多态性减少的位点为80个，总体上Hetero簇的核苷酸多态性大于MSM簇。另有DL 21和DL 70两例毒株位于MSM和Hetero亚簇之外，与泰国及广西参考株遗传距离相近)。

图 1

注：●男男同性传播；◆异性传播 图 1 大连市HIV-1毒株 Env区系统进化树图

将上述研究对象env序列与非洲，泰国，越南参考株及国内部分地区CRF 01_AE流行株Env序列共同构建系统进化树，大连市MSM簇毒株与北京、辽宁和吉林的MSM流行株在系统进化树上位于同一分支，聚集成1个较大的MSM簇；而大连市Hetero簇则与北京、辽宁、天津的MSM流行株及江苏的异性性传播毒株位于同一分支，聚集成1簇，因该簇大连流行株中异性传播占主导地位，仍将其命名为Hetero簇。2簇内均无国外流行株，其中Hetero簇中大连毒株与辽宁MSM毒株位于同一细小分支，形成1个亚簇，命名为Hetero-DL簇；Hetero簇中DL 84毒株为异性接触传播，与多株北京市MSM毒株位于同一细小分支，与天津MSM毒株及江苏1例异性接触传播毒株遗传距离相近；另有2株位于MSM簇和Hetero簇之外的异性传播毒株与泰国，越南，云南和广西毒株位于同一分支，聚集成1个以异性性接触及IDU为传播途径的分支，命名为Hetero & IDU簇。其中DL 21标本与云南IDU毒株和泰国毒株进化距离相近，DL 70标本与越南，广西，福建，江苏的异性传播毒株进化距离相近。

图 2

注：●男男同性传播；◆异性传播；▲IDU 图 2 大连市CRF01_AE亚型株与国际＆国内 CRF 01_AE流行株Env区系统进化树图

CRF 01_AE是最早被证实的HIV-1循环重组型毒株，1989年在泰国北部的商业性服务妇女中首次检出^{[9, 10]}，后续研究证实毒株十九世纪七十年代起源于非洲，八十年代以异性接触传播于泰国等东南亚国家^{[11, 12]}。中国的CRF 01_AE亚型最早于1994年在泰国返回云南的性服务妇女中发现^[13]，1996年报道在广西地区静脉吸毒和异性传播人群中有CRF 01_AE毒株流行^[14]。1996—2006年进行的3次全国HIV分子流行病学调查结果显示^{[15, 16]}，中国CRF 01_AE所占比例已从9.6%增长到27.5%，毒株主要流行于异性接触及静脉吸毒人群中，近期分子流行病学调查显示CRF 01_AE已成为中国部分地区的主要流行亚型，亚型中所占比例呈快速增长趋势^{[17, 18, 19]}，男男同性接触感染者中CRF 01_AE占主导优势^{[20, 21]}。

相关研究表明，中国的CRF 01_AE流行具有明显的地域及高危行为特征^[22]。本研究中大连的CRF 01_AE流行株通过系统进化及进化距离的基因离散率分析，提示MSM簇传入大连市的时间晚于Hetero簇，按照Env区碱基替换率为6.59(5.96~7.21)×10^-3/位点/年估算^[22]，MSM簇毒株传入大连时间约为1999—2005年，Hetero簇传入大连时间约为1998—2004年，其中MSM簇传入时间与大连地区2003年首次在男男同性恋人群中发现HIV感染者时间相符，推测CRF 01_AE可能为大连地区男男同性人群中最早流行的亚型。

大连地区CRF 01_AE株与其他地区CRF 01_AE亚型株Env基因系统进化树(图 2)显示，大连MSM簇毒株与地理位置相近的北京，辽宁和吉林MSM主要流行株遗传距离较近，可能在中国北方地区men who have sex with men(MSM)人群中有多次相互传播过程；大连Hetero簇分析结果提示大连异性传播的CRF 01_AE与辽宁MSM株存在地域聚集性，与辽宁等地域相近、交通便利地区的主要流行株存在多次相互传播，部分异性传播毒株与东南沿海地区流行株进化距离较近，不排除经由东南沿海地区以性传播途径传入的可能性；此外Hetero & IDU簇中的大连毒株系统进化特征提示大连的CRF 01_AE株应该有>2个传播链，可能部分毒株由中国南方地区直接传入；值得注意的是MSM和Hetero簇内均混有异性及同性流行株，尤其Hetero-DL簇与辽宁的MSM毒株汇聚成簇，提示大连市CRF 01_AE株可能通过双性恋人群在MSM及异性接触人群中多次传播。同时不排除由于社会及家庭等压力因素，导致MSM感染者隐瞒自己的性取向的可能性，致使流行病资料与实际不符，表现为系统进化树上部分流行病资料为异性传播的毒株位于MSM簇中。

结合现有研究观点^{[22, 23, 24, 25]}，本研究认为大连地区的CRF 01_AE亚型株源于泰国，90年代中期通过异性接触和静脉吸毒人群传入云南和广西地区，流行于中国南方部分省份，后以性传播途径直接或经由中国东南沿海部分地区传入北方及大连地区，传入时间约为1998—2005年间，流行株为多点传入，存在2个以上传播链，分别在MSM及异性性接触人群中传播，其中异性性接触人群中流行要早于MSM人群；男男同性传播在CRF 01_AE感染者中占主导优势，系统进化分析提示大连CRF 01_AE亚型株与中国北方地区的MSM人群CRF 01_AE亚型株有多次传播过程。