副溶血弧菌广泛分布于世界沿海地区，是引起食源性疾病的重要病原菌之一^[1]。1996年自印度加尔各答分离出一种tdh⁺、trh^-新的03：K6型克隆群后此菌引起的疾病发生率急剧增加^[2]。目前该克隆群已引起全球许多国家副溶血弧菌疾病大流行^{[3, 4]}。同样在中国特别是沿海地区，副溶血弧菌引起的食物中毒已高居微生物性食物中毒首位^{[5, 6]}。自2012年以来，辽宁省副溶血弧菌一直居于腹泻病原的首位。为了解副溶血弧菌主要流行血清型、分子分型以及毒力因子分布，为该病的防控提供技术支撑，本研究选取了2012年37株、2013年64株辽宁地区腹泻病人中分离的副溶血弧菌进行表型及基因型特征分析，现将结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 菌株来源及鉴定

副溶血菌株从2012—2013年辽宁省省腹泻病例分离得到，所有菌株按照WS271-2007《感染性腹泻诊断标准》附录B.3^[7]，采用法国梅里埃公司API20NE生化试剂条鉴定为副溶血弧菌。沙门氏菌标准菌株H9812(国家疾病预防控制中心提供)。 1.2 主要试剂与仪器

副溶血弧菌诊断血清(中国天津生物芯片技术有限公司)；药敏板(美国Thermo公司)；限制性内切酶Xba I、Not I、DL2000 Marker、Taq Premix、琼脂糖[中国宝生物工程(大连)有限公司]；Seakem Gold低熔点琼脂糖(美国LONZA公司)；细菌DNA提取试剂盒(德国Qiagen公司)。PCR基因扩增仪(美国Bio-Rad公司,IQ5)、脉冲场凝胶电泳仪(美国Bio-Rad公司,CHEF Mapper)、凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司，GEL Doc2000)。引物由中国Invitrogen公司完成，序列见表 1。

表 1

表 1 副溶血弧菌毒力及调控基因引物 目的 基因 引物序列 (5′-3′) 退火温度 (℃) 扩增长 度(bp) tlh F aaa gcg gat tat gca gaa gca ctg 60 455 R gct act ttc tag cat ttt ctc tgc trh F ttg gct tcg ata ttt tca gta tct 55 500 R cat aac aaa cat atg ccc att tcc g tdh F gta aag gtc tct gac ttt tgg ac 55 256 R tgg aat aga acc ttc atc ttc acc

表 1 副溶血弧菌毒力及调控基因引物

副溶血弧菌的血清分型使用玻片凝集法，生理盐水作为对照。采用天津基因芯片公司产品，该血清分为13个O抗原血清，65个K抗原血清。 1.3.2 药物敏感试验

采用美国Thermo公司的Sensititre药敏系统，采用微量肉汤方法在干燥的板条上进行测试并提供定性(敏感或耐药)和定量的最小抑制浓度(minimal inhibition concentration，MIC)结果。每块板都包被有适量稀释度的抗生素试剂。所用药物为环丙沙星(ciprofloxacin,CIP)、甲氧苄啶(sulfamethoxazole/trimethoprim,SXT)、磺胺甲恶唑(sulfamethoxazole,SMX)、亚胺培南(imipenem,IMI)、头孢曲松钠(ceftriaxone sodium,AXO)、阿莫西林/克拉维酸(amoxicillin/clavulanate,AUG2)、氨苄西林(ampicillin,AMP)、萘啶酸(nalidixic acid,NAL)、氯霉素(chloromycetin,CHL)、庆大霉素(gentamycin,GEN)、四环素(tetracycline,TET)、链霉素(streptomycin,STR)、阿奇霉素(azithromycin,AZI)、头孢西丁(cefoxitin,FOX)、强力霉素(doxycycline,DOX)、头孢吡肟(cefepime,FEP)。质控菌株大肠埃希菌ATCC25922由国家疾病预防控制中心中心提供。 1.3.3 毒力基因检测

101株菌株37 ℃培养过夜，使用细菌基因组DNA试剂盒提取基因组DNA，-20 ℃保存。进行3种毒力基因分析，引物序列见表 1。扩增条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃，1 min；退火温度，1 min；72 ℃，1 min，30个循环；72 ℃，5 min。扩增产物经电泳后于凝胶成像系统中观察结果。 1.3.4 PFGE(pulsed field gel electrophoresis)实验

按照中国细菌性传染病分子分型实验室监测网络(PulseNet China)监测网络中副溶血弧菌PFGE标准分型方法^[8]，对101株副溶血弧菌进行分子分型。沙门菌标准株H9812作为分子量标准。副溶血弧菌采用内切酶NotⅠ(60U)，37 ℃ 酶切>4 h；沙门菌标准株H9812采用内切酶Xba Ⅰ(60U)，37 ℃酶切>2 h.电泳条件：12.55-30.82s，电泳19 h。脉冲场凝胶电泳仪为美国Bio-Rad公司的CHEF MAPPER。PFGE图像应用Bio Numerics软件(Version 6.6，Applied Maths)处理。 1.4 统计分析

采用SPSS 13.0软件进行数据分析，计数资料采用χ²、Fisher检验。P<0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 血清型分布

101株副溶血弧菌分为25种不同的血清型，包括9种O型，19种K型。以O3：K6型为主，共38株菌，所占比例为37.62%；O4：K8共18株，占17.82%。其他血清型包括O1:K1、O1:K36、O1:K60、O2:K28、O3:K3、O3:K5、O3:K11、O3:K56、O4:K4、O4:K9、O4:K56、O4:K61、O4:K68、O5:K30、O5:K60、O5:K63等，每种血清型都比较分散，菌株数不超过5株。另外还包括O群凝集而K群不凝集的O4：KUT 3株、O5：KUT 4株。 2.2 毒力基因分布

用PCR方法对101株菌进行tlh、tdh和trh毒力基因检测，其中tlh基因存在于全部菌株中；对于tdh，101株菌中85株菌检测为阳性，阳性率84.16%；trh毒力基因检测全部为阴性。tdh基因在O3：K6型菌株和非O3：K6型菌株的携带率分别为100%(38/38)和76.19%(48/63)，前者的阳性率更高，经Fisher精确检验，差异有统计学意义(P=0.000 81)。 2.3 抗生素敏感性(表 2)

101株副溶血弧菌对环丙沙星、强力霉素和头孢吡肟敏感率最高，为100%；其次是甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、亚胺培南、头孢曲松钠、阿莫西林/克拉维酸、萘啶酸、氯霉素，敏感率为99.01%；对庆大霉素、四环素、阿奇霉素、头孢西丁也具有较高的敏感性，敏感率均超过90.00%。敏感性最低的是磺胺甲恶唑，只有24.75%；对链霉素(29.70%)和氨苄西林(23.76%)的敏感性也较低。

表 2

表 2 副溶血弧菌对16种抗菌药物的耐药情况 抗菌药物 菌株数 敏感率(%) 菌株数 中度敏感率(%) 菌株数 耐药率(%) 环丙沙星 101 100.00 0 0.00 0 0.00 强力霉素 101 100.00 0 0.00 0 0.00 头孢吡肟 101 100.00 0 0.00 0 0.00 头孢曲松钠 100 99.01 0 0.00 1 0.99 阿莫西林/克拉维酸 100 99.01 0 0.00 1 0.99 甲氧苄啶/磺胺甲恶唑 100 99.01 0 0.00 1 0.99 亚胺培南 100 99.01 0 0.00 1 0.99 萘啶酸 100 99.01 0 0.00 1 0.99 氯霉素 99 98.02 1 0.99 1 0.99 阿奇霉素 97 96.04 2 1.98 2 1.98 庆大霉素 97 96.04 1 0.99 3 2.97 四环素 97 96.04 0 0.00 4 3.96 头孢西丁 92 91.09 6 5.94 3 2.97 氨苄西林 24 23.76 17 16.83 60 59.41 链霉素 30 29.70 0 0.00 71 70.30 磺胺甲恶唑 25 24.75 4 3.96 72 71.29

表 2 副溶血弧菌对16种抗菌药物的耐药情况

经Not Ⅰ酶切，101株副溶血弧菌产生63种PFGE型别，38株O3:K6型菌株分成19种PFGE型别，总体相似度为54.147%，带型分散，每种带型所包含的菌株最多不超过7株。在对2013年辽宁省副溶血弧菌PFGE分子分型结果比对分析中，发现3株来自沈阳的O3:K6型菌株PFGE电泳条带相同，4株来自盘锦的O3:K6型菌株PFGE电泳条带相同，其他各带型间无地区和时间分布差异。

图 1

图 1 辽宁省101株副溶血弧菌Not Ⅰ酶切的PFGE聚类图

辽宁地区副溶血在散发腹泻病例中的检出率已连续两年位于第一位，成为本地区引起感染性腹泻的主要致病菌之一。自1953年在日本首次发现副溶血弧菌，至今已有13种O血清型和71种K血清型。1996年以前，副溶血弧菌的血清型主要以O4：K8为主，1996年后，新的O3：K6型克隆群占主要优势，并引起副溶血弧菌腹泻发病率增高^{[9, 10, 11]}。本研究显示，辽宁地区副溶血弧菌血清型有25种，其中以O3：K6、O4：K8为主，同时又存在多种新的血清型。血清型的多样性是辽宁地区副溶血弧菌腹泻病呈高发态势的原因之一。副溶血弧菌的致病作用主要与其溶血素密切相关^[12]。目前研究最多的是不耐热溶血素(thermolabile hemolysin,TLH)、耐热直接溶血素(thermostable direct hemolysin,TDH)和耐热直接溶血素相关溶血素(TDH-related hemolysin,TRH)，分别由tlh、tdh和trh基因编码。本研究显示实验菌株100%携带tlh，因此tlh可作为副溶血弧菌检测的标志物，进行早期快速诊断。绝大多数临床分离株为tdh⁺trh^-菌株，带有tdh基因的菌株致病力和感染性较强。本研究结果显示辽宁省散发病例感染的副溶血O3：K6型菌株tdh基因的携带率要明显高于非O3：K6型菌株。这一结果从毒力因子角度证实Yeung^[13]等报道的O3：K6型副溶血弧菌可能比其他血清型更能导致腹泻和感染，且与亚洲其他国家和国内一些省市流行型别一致^{[14, 15]}。不同地区副溶血弧菌流行株的血清型不同，且不同血清型的菌株对人的致病性也有一定的差异。因此，长期、持续监测副溶血弧菌，对其血清型进行鉴定和分析，对于揭示其流行规律，预防和控制其在人群间的感染和传播具有重要意义。副溶血弧菌对磺胺甲恶唑、链霉素和氨苄西林的耐药性比较高，分别是71.29%、70.3%和59.41%，表明从病例中分离的副溶血弧菌对这3种药已出现耐药现象。而对于环丙沙星、强力霉素和头孢吡肟药物都非常敏感，敏感率达到100%。因此，临床治疗由副溶血弧菌引起的感染性腹泻时，应首选以头孢吡肟为代表的头孢类药物等上述敏感类药物。

PFGE作为菌株基因组指纹图谱的分析手段，具有更高的分辨率，可以分析同一时段内不同地区散在分布的菌株之间内在差异和联系。本研究将101株散发病人副溶血弧菌分成63种型别，其中优势血清型O3:K6型菌株分成19种PFGE型别，揭示辽宁地区来自于散发腹泻病例的副溶血弧菌，遗传学上高度分化，具有多克隆来源。在对2013年辽宁省副溶血弧菌PFGE分子分型结果比对分析中，发现来自沈阳的3株O3:K6型菌株PFGE电泳条带相同，4株来自盘锦的O3:K6型菌株PFGE电泳条带相同，提示辽宁地区存在由副溶血弧菌引起的腹泻病暴发的可能。后续研究和监测若增加食品和外环境分离株的分子分型，将来自临床病例的菌株型别和环境中的菌株型别比对，分析菌株之间的相关性，找出引起副溶血弧菌腹泻的危险因素和可疑食品，从源头控制传染源，更好地做到疾病的溯源和预警。