汉坦病毒(hantavirus，HV)可引起肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)和汉坦病毒肺综合征(hantavirus pulmonary syndrome，HPS)^{[1, 2]}。国内外对不同型别HV与自然宿主、生态环境和进化方面进行了研究，表明自然宿主与HV相关疾病的流行范围和流行强度有关^[3]。而且病毒基因组核苷酸序列所构建的系统发生树显示病毒与宿主动物之间的共同进化关系^[4]。然而，随着病原学研究的深入，这种共进化观点受到质疑，一些学者认为HV的宿主类型决定了病毒型的差异，HFRS的流行及疫区的演变是病毒与宿主相互作用的结果^[5]。本研究选择汉坦病毒宿主动物线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)上的D-loop和Cyt b 基因作为分子标记，分析浙江省2013年HV与宿主之间相互作用的进化规律。现将结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 标本

2013年鼠肺标本采自浙江省各HFRS监测点，采用5 m夹夜法，晚放晨取捕鼠，将捕获的鼠类经分类鉴定和登记后，无菌解剖采集715份鼠肺。 1.2 主要试剂

DNA提取试剂盒Rneasy Mini Kit (美国Qiagen公司) ； M-MLV逆转录酶、DNA Taq酶、聚合酶链反应(PCR)相关试剂、Agrose胶纯化试剂盒(日本TAKARA中国分公司)。引物由上海生物工程公司合成。核苷酸序列测定委托上海生物工程公司完成。 1.3 方法 1.3.1 直接免疫荧光法

直接免疫荧光法共检测鼠肺标本715份，在荧光显微镜下，使用488 nm激发光，HV抗原阳性鼠肺标本中可见到细胞质中有特异性的针尖状或团块状黄绿色荧光颗粒，阴性标本在荧光镜下细胞无特异性黄绿色荧光颗粒，胞浆呈暗红色。 1.3.2 鼠肺组织线粒体D-loop和Cyt b的PCR检测

参照说明书提取部分HV抗原阳性和阴性鼠肺的组织总DNA，-70 ℃保存备用。参考Genbank中已知的核苷酸序列，设计合成线粒体D-loop 和Cyt b基因的引物。D-loop的引物：上游：5′-CTCCCYACCATCARCWCCCAAAGCTG-3′，下游：5′-AGACCCGTACCATCGAGATGTCTT-3′。Cyt b基因的引物：上游：5′-ATGACAAACATCCGAAAAACTCACC-3′，下游：5′-AGATTGGCATAAAGATTAGG-3′。配制PCR反应液，混匀后放入PCR仪，反应条件为：94 ℃预变性1 min，94 ℃变性50 s，55 ℃退火50 s，72 ℃度延伸1 min，循环30次,最后72 ℃延伸10 min。 1.3.3 核苷酸序列的测定和分析

对PCR产物进行凝胶纯化，核苷酸序列测定，将测定的序列结果拼接后的核苷酸序列，应用生物学软件ClustalX软件进行多重序列同源性分析，使用Mega软件绘制系统发生树。 2 结 果 2.1 宿主动物监测情况

2013年，共捕获汉坦病毒自然宿主鼠715只，均为中国已报道的HV宿主。分为13个鼠种：褐家鼠、黑线姬鼠、黄胸鼠、黄毛鼠、臭鼩鼱、小家鼠、东方田鼠、社鼠、针毛鼠、黑腹绒鼠、中华姬鼠、黑家鼠，白腹巨鼠。捕获的鼠种以黑线姬鼠为优势鼠种，占47.5%，其次为黄毛鼠，占24.5%。 2.2 宿主动物带毒率

715份标本中，HV抗原检测阳性的标本为44份，总带毒率为6.15%，其中31份阳性标本来自黑线姬鼠，带毒率为9.12%(31/340)，7份标本来自褐家鼠，带毒率为4.0%，(7/175)，5份标本来自东方田鼠，带毒率为16.1%(5/31)，白腹巨鼠带毒率为16.7%(1/6)，其余鼠种经过检测，未发现HV呈阳性。结果表明浙江地区汉坦病毒的自然宿主主要为黑线姬鼠和褐家鼠。2013年浙江省HFRS监测点鼠肺抗原检测阳性率最高的是龙泉，为9.9%(15/151)；最低的是鄞州，为0%。 2.3 宿主动物线粒体D-loop序列分析

选择2013年浙江省监测点天台、龙泉、龙游、鄞州、江山主要的HV自然宿主黑线姬鼠进行病毒与宿主的共进化分析。构建采集自不同地区HV阳性黑线姬鼠鼠肺标本4份以及7份HV检测阴性黑线姬鼠标本的D-loop序列系统进化树，结果显示HV抗原检测阴性的鼠与HV检出阳性鼠的遗传距离处于一个分支上。感染病毒与否和宿主线粒体基因之间并无直接联系。

图 1

注：tt：天台；ly：龙游；lq：龙泉；+、-分别代表HV检测结果为阳性、阴性。 图 1 HV抗原阳性和阴性黑线姬鼠鼠肺的D-loop系统进化树

构建采集自不同地区阳性黑线姬鼠鼠肺标本20份以及10份HV检测阴性黑线姬鼠标本的Cyt b基因序列系统进化树，结果显示每个分支上均有HV阳性和阴性的鼠。龙游和龙泉地区的黑线姬鼠无论是否感染病毒，分别聚集在一个大分支上，但是天台的黑线姬鼠和龙泉和龙游的有交叉。基于线粒体Cyt b基因的系统进化树上，病毒感染与宿主线粒体基因之间并无直接联系。

图 2

注：ly：龙游；,lq：龙泉；tt：天台； +、-分别代表HV检测结果为阳性、阴性。 图 2 HV抗原阳性和阴性黑线姬鼠鼠肺的Cyt b基因系统进化树

汉坦病毒属于布尼亚病毒科汉坦病毒属(hantavirus，HV)^[1]，其宿主为小型哺乳动物，主要是携带病毒的啮齿动物通过尿液，粪便，唾液等排泄物感染人群，为典型的自然疫源性疾病^[6]。宿主动物与HV病毒之间有共进化假说^{[4, 7]}和宿主决定论假说^{[5, 8]}，由于线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)是动物体内唯一存在核外的遗传物质，被广泛用于动物群体遗传多样性、分子进化、群体遗传结构等方面的研究，其中D环区(D-loop)和 Cyt b基因目前已经成为研究物系统进化的理想工具^{[9, 10, 11]}。本研究应用ClustalX和 MEGA 5.0软件，选择mtDNA上的D-loop和Cyt b 基因作为分子标记，以邻位相连法(NJ)构建系统发生树，对汉坦病毒自然宿主的线粒体进行了进化分析，发现HV感染与宿主线粒体D-loop基因和Cyt b基因并无联系，同一个鼠种(本研究以黑线姬鼠为例)，无论是否感染HV，其D-loop和Cyt b基因序列可处于同一小分支。对HV检测阳性的老鼠其线粒体序列无特异性的发现，但从对黑线姬鼠的地理聚集分类来说，Cyt b基因更适用于黑线姬鼠种内遗传分化。Liu等^[5]曾尝试对湖北地区的啮齿动物的线粒体D-loop序列进行聚类分析，HV阳性和阴性动物也并未发现明显差异。因此利用宿主的线粒体序列来构建的进化树并不支持HV病毒与宿主动物之间的共同进化关系的观点。然而，对于另一学说，即HV的宿主类型决定了病毒型的差异，由于本研究只选用了黑线姬鼠的线粒体序列进行进化分析，并不涉及其他鼠种和宿主动物，而且阳性的病毒均属于一个基因型，也并不能完全说明HV的宿主类型决定了病毒型的差异，目前只能说明同一宿主其可能携带的病毒基因型相同，但是否宿主对病毒型别有决定作用，需要对其他基因型的汉坦病毒以及宿主进行进一步的分析，但也有可能是本研究还没有找到更具有代表性的基因，这也需要进一步的探索。