Beagle犬因其体型小、形态和体质均一、禀性温和、便于操作、对环境的适应力和抗病力较强、产仔数多等优点，被公认为是较理想的实验用犬^{[1, 2, 3]}，已被广泛用于生物医药等相关领域研究中。 但由于其吠叫音量较大，可能对实验室或设施周围环境产生噪音困扰。目前常用的声带切除消声方法存在手术过程复杂、难度高、危险大、术后护理困难等缺点，且术后经常出现消声不彻底和声音恢复现象^{[4, 5, 6]}。因此，寻求一种简单易行、危险小、痛苦少的消声方式成为实验动物学领域的迫切需要。喉返神经是喉的主要神经，喉返神经损伤可能出现不同程度的发声障碍^{[7, 8]}，右侧喉返神经损伤的机率更大^[9]。本研究采用切断犬喉返神经方法制备犬消声模型，并评价切断喉返神经手术对犬生理生化及相关功能的影响，以期获得安全有效的消声实验动物模型。结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 实验动物

普通级成年Beagle 犬12 条，体重10～14 kg，雌雄各半，由沈阳康平实验动物研究所提供，生产许可证号：SCXK(辽)2014-0003。饲养在沈阳药科大学实验动物中心，使用许可证号：SYXK(辽)2014-0004，普通级Beagle犬饲养室温度16~26 ℃，相对湿度40%~70%。饲喂膨化颗粒饲料，用开水浸泡，每天早晚定时定量饲喂，单只单笼饲养。 1.2 主要试剂与仪器

95%乙醇(天津市大茂化学试剂厂)；聚维酮碘溶液(山西威尔潞威动物保健品有限公司)；陆眠宁Ⅰ、强效鹿醒宁(吉林华牧动物保健品有限公司)；注射用青霉素钠(黑龙江哈药集团制药总厂)。HT-8352 专业声级计(广州市宏诚集业电子科技有限公司)；7020全自动生化分析仪(日本Hitachi 公司)；ADVIA-2120i全自动血液分析仪(德国Siemens公司)；RM6240多道生理信号采集处理系统(成都仪器厂)。 1.3 分组与处理

12条Beagle 犬按体重随机分为2组，每组6条，雌雄各半。对照组犬进行假手术处理，模型组犬进行犬喉返神经切断手术。术前12 h禁食，按0.03~0.05 mL/kg静脉注射陆眠宁Ⅰ麻醉；待犬呼吸均匀进入深度麻醉后，固定于手术台上，颈前正中剃毛，并对手术野进行碘酒和75%酒精双重消毒；颈前正中切口，上达喉头，下至锁骨水平，暴露颈部带状肌及气管食管间沟，轻轻提拉两侧肌肉组织，剥离结缔组织，模型组剥离至可视右侧喉返神经，切断喉返神经，而对照组不切断喉返神经，最后将肌肉和皮肤组织依次缝合；术后饲喂流食1周，每天静脉推注青霉素钠160万单位，连续2周。每日观察记录犬健康状况及发声情况。 1.4 指标与方法 1.4.1 犬术后吠叫音量检测

分别于术后3、6个月，将模型组与对照组犬固定在固定架上，用声级计记录吠叫噪声值，同时检测当时环境噪声值，吠叫音量[dB(A)]=吠叫噪声值-环境噪声值。 1.4.2 血液生理指标测定

分别于术后3、6个月，犬空腹12 h后，采前肢静脉血2 mL，置于涂有抗凝剂的真空管中，4 ℃保存，用ADVIA-2120i全自动血液分析仪测定22项血常规指标，包括：白细胞数、中性粒细胞百分比、淋巴细胞百分比、单核细胞百分比、嗜酸性粒细胞百分比、嗜碱性粒细胞百分比、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、红细胞、血红蛋白、红细胞压积、红细胞平均体积、平均血红蛋白量、平均血红蛋白浓度、红细胞分布宽度、血小板、血小板压积、平均血小板体积和血小板分布宽度。 1.4.3 血液生化指标分析

分别于术后3、6个月，犬空腹12 h后，采前肢静脉血5 mL，置于涂有促凝剂的真空管中，4 ℃保存，4 ℃、3 500 r/min离心10 min；用7020全自动生化分析仪分析丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天门冬氨酸转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)、白蛋白、总胆红素、尿素、肌酐和葡萄糖8个指标。 1.4.4 心电图及呼吸运动检测

分别于术后3、6个月，非麻醉状态下固定Beagle犬，用RM6240多道生理记录仪，采用标准肢体Ⅱ导联法检测对照组和模型组犬的心电图。将呼吸罩置于动物口鼻处，连接RM6240多道生理记录仪，采用呼吸运动法(流量法)检测犬的呼吸运动。 1.5 统计分析

数据采用x±s表示，采用SPSS 17.0 软件对数据进行统计分析，组间比较采用方差分析，两两比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 喉返神经切断对犬一般状况及吠叫音量影响

术后1~2个月，Beagle 犬伤口完全愈合，精神状态良好，饮食正常，其中模型组犬发声功能明显减弱。术后3、6个月，对照组Beagle犬吠叫音量分别为(41.83±4.87)、(48.62±2.19)dB(A)，模型组Beagle犬吠叫音量分别为(33.04±2.34)、(35.20±1.98) dB(A)；模型组Beagle犬吠叫音量均低于对照组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。 2.2 喉返神经切断对犬血液生理指标影响(表 1)

结果显示，术后3和6个月时，与对照组比较，模型组Beagle犬白细胞数等22项血液生理指标差异均无统计学意义(均P>0.05)。

表 1

表 1 切断右侧喉返神经对Beagle犬血液生理指标影响(x±s,n=6) 指标 3个月 6个月 模型组 对照组 模型组 对照组 白细胞数(109/L) 11.91±2.79 14.83±3.14 13.31±2.19 11.24±2.60 中性粒细胞百分比(%) 66.85±4.94 55.92±24.81 57.95±12.94 60.72±6.40 淋巴细胞百分比(%) 33.68±2.02 42.1±25.6 43.28±26.20 30.73±3.60 单核细胞百分比(%) 0.535±0.86 0.65±0.64 0.55±0.16 0.522 2±0.19 嗜酸性粒细胞百分比(%) 1.9±1.06 1.133±0.95 1.56±0.96 2.62±2.36 嗜碱性粒细胞百分比(%) 0.57±0.27 0.2±0.20 0.37±0.22 0.88±0.12 中性粒细胞(109/L) 7.56±2.02 8.3±4.20 7.56±3.02 6.67±2.03 淋巴细胞(109/L) 6.1±2.58 6.283±4.05 6.58±2.12 5.31±2.74 单核细胞(109/L) 0.13±0.06 0.1±0.10 0.10±0.05 0.12±0.05 嗜酸性粒细胞(109/L) 0.39±0.25 0.15±0.10 0.29±0.15 0.25±0.18 嗜碱性粒细胞(109/L) 0.062±0.02 0.043±0.05 0.092±0.01 0.097±0.02 红细胞(1012/L) 7.95±0.55 7.383±0.85 8.05±0.43 8.22±0.35 血红蛋白(g/L) 159.0±11.90 141.8±11.5 161.0±10.90 163.5±8.60 红细胞压积(%) 45.88±3.65 42.6±3.60 48.58±3.14 49.2±2.69 红细胞平均体积(fL) 57.73±3.27 57.95±4.19 59.23±3.12 59.91±3.86 平均血红蛋白量(pg) 19.98±1.16 19.32±1.47 19.68±1.86 19.92±1.41 平均血红蛋白浓度(g/L) 346.3±5.30 333.3±3.90 336.3±7.40 332.7±6.00 红细胞分布宽度(%) 16.93±1.90 19.6±3.80 16.93±1.90 17.4±1.44 血小板(109/L) 344.83±90.03 410.5±128.60 324.83±96.13 330.5±100.63 血小板压积(%) 0.48±0.19 0.3517±0.12 0.47±0.12 0.48±0.14 平均血小板体积(fL) 8.13±1.54 8.533±1.29 9.25±1.70 9.65±1.12 血小板分布宽度(%) 15.92±1.96 16.17±0.82 16.49±3.90 16.38±2.40

表 1 切断右侧喉返神经对Beagle犬血液生理指标影响(x±s,n=6)

结果显示，术后3和6个月时，与对照组比较，模型组Beagle犬碱性磷酸酶等8项血液生化指标差异均无统计学意义(均P>0.05)。

表 2

表 2 切断右侧喉返神经对Beagle犬血液生化指标影响(x±s,n=6) 指标 3个月 6个月 模型组 对照组 模型组 对照组 AKP(U/L) 154.98±20.09 137.17±47.82 164.98±20.09 165.75±17.62 ALT(U/L) 33.28±10.84 36.33±8.12 32.18±6.14 35.3±6.21 AST(U/L) 31.42±9.66 42.83±10.28 31.32±7.86 34.7±7.77 尿素(mmol/L) 3.49±1.05 2.66±0.70 2.19±0.85 2.69±0.53 肌酐(mmol/L) 75.42±14.30 59.05±11.63 65.42±11.30 66.43±10.77 总胆红素(μmol/L) 2.32±0.44 1.78±0.41 1.92±0.34 1.88±0.75 葡萄糖(mmol/L) 5.45±0.90 3.99±0.38 4.85±0.50 4.95±0.30 白细胞(g/L) 32.97±4.34 32.02±2.28 34.17±3.73 35.35±3.50

表 2 切断右侧喉返神经对Beagle犬血液生化指标影响(x±s,n=6)

结果显示，术后3和6个月时，与对照组比较，模型组Beagle犬呼吸频率等2项呼吸运动指标及心率等9项心电图参数差异均无统计学意义(均P>0.05)。

表 3

表 3 切断右侧喉返神经对Beagle犬呼吸运动及心电图参数影响(x±s,n=6) 指标 3个月 6个月 模型组 对照组 模型组 对照组 呼吸频率(min-1) 33.79±1.22 29.72±3.86 34.34±1.22 30.82±4.36 平均呼吸深度(mL/s) 18.24±4.89 21.31±1.72 17.14±2.39 18.13±2.70 心率(min-1) 133.69±21.56 128.12±17.29 138.63±10.40 118.33±17.42 P波(μV) 212.13±54.76 207.23±59.86 212.13±54.76 197.61±49.86 Q波(μV) 109.76±14.73 85.24±24.15 69.76±21.53 85.24±19.75 R波(μV) 536.49±118.40 484.81±36.27 549.36±129.30 374.81±39.99 S波(μV) 147.05±44.42 142.92±54.66 172.05±48.22 182.92±53.66 T波(μV) 74.86±35.24 98.37±61.81 104.18±31.94 102.01±68.17 P-R(ms) 103.34±13.23 90.04±11.35 113.34±23.23 130.04±12.75 QRS(ms) 75.12±20.81 64.65±8.03 68.02±18.91 54.65±7.93 Q-T(ms) 206.33±15.66 191.86±23.01 198.33±11.81 184.86±13.96

表 3 切断右侧喉返神经对Beagle犬呼吸运动及心电图参数影响(x±s,n=6)

目前，对宠物犬进行消声手术有多种方法，但均存在不足，如给犬戴消声项圈^[10]容易改变其生活方式；声带切除消声^{[4, 5]}存在手术过程复杂、难度高、危险大、声音恢复等缺陷，而且因手术野较大产生应激反应^[11]会导机体生理紊乱，甚至死亡。而采用喉返神经切断法制备动物消声模型则能够克服上述不足。喉返神经与甲状腺、食管、气管、颈部血管关系密切，临床上进行颈部手术时，尤其是甲状腺肿大、甲状腺癌等疾病需要切除甲状腺时，喉返神经极易损伤致使患者出现声音嘶哑或失声等并发症^{[12, 13]}。本研究采用损伤喉返神经方法制备的Beagle犬消声动物模型，即可为临床上甲状腺切除或外伤致使喉返神经损伤引起的音声嘶哑、失声等症状的治疗与康复研究提供理想动物模型，又可用于研究喉返神经损伤后的神经修复、再生等相关研究，有利于提高患者术后的生活质量。

喉返神经是喉的主要神经^{[14, 15, 16]}，喉返神经受刺激时，声门呈内收，可发声。当喉返神经切断性损伤后，外展功能受损^[17]，长期失神经支配的肌肉出现萎缩^[18]，导致喉结构改变，杓状软骨移位，声带松弛，声带固定于旁正中位，呈弓状弯曲，发音时健侧声带不能代偿，声门间隙较大，致使发声障碍^[19]，难以恢复。所以喉返神经在消声动物模型的制备领域中具有重要的应用价值。研究表明切断Beagle犬双侧喉返神经的动物消声虽然比较彻底，但术后4~5 个月时个别犬出现间歇式呼吸困难症状^[20]，其原因可能与两侧喉返神经损伤后，两侧声带均不能外展而相互近于中线，声门呈小裂隙状，从而导致呼吸困难^{[17, 21]}。故本研究选择单侧喉返神经切断手术方法制备消声模型，结果显示，切断右侧喉返神经后术后3、6个月Beagle犬的吠叫音量明显降低，且不影响模型犬的正常呼吸和心脏功能，术后血液生理生化指标基本正常。

在建立模型过程中，充分了解Beagle犬喉返神经解剖学特点及外科手术技术是建立模型成功的关键。实验人员应做好充分术前准备，手术操作应谨慎，术后护理应细致。手术应符合无菌、减少组织创伤、维持生命体征原则，才能确保手术成功。实验动物手术后，由于手术麻醉、组织损伤、手术时细菌污染等因素，可能导致多种术后并发症，甚至危及动物生命。因此应重视术后护理和各种异常情况的及时处理，提高模型制备成功率。