氟骨症是长期摄入过量氟引起的骨病变，其发病机制至今未能阐明。近年来研究显示，Notch信号通路在细胞分化、增殖中起重要作用，对骨细胞的分化具有重要影响^[1]。本研究通过建立慢性氟中毒大鼠模型，观察骨组织中Notch信号通路关键信号分子-核转录抑制因子(recombination signal-binding protein-J kappa,RBPJ)表达水平变化，并观察其下游效应靶基因Hes 5表达变化，旨在了解氟中毒时骨组织内Notch通路信号分子的变化及作用，探讨RBPJ在氟骨症发病机制中的作用。结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 主要仪器与试剂

Bio-rad电泳槽(美国Bio-rad公司),CFX 96^TM实时定量PCR仪(美国Bio-rad公司),Chemi Doc XRS凝胶成像系统(美国Bio-rad公司)。兔抗 Jagged 1(Jag1)单克隆抗体(英国Abcam公司)，兔抗RBPJ单克隆抗体(美国Cell Signaling公司)，兔抗Hes 5多克隆抗体(美国Genetex公司)，Immobilon 化学发光试剂(美国Millipore公司)，PV-9001兔超敏二步法免疫组化检测试剂(北京中杉金桥生物技术有限公司)，Trizol Reagent(美国 Invitrogen公司)，RevertAid First Strand cDNA Synthes(美国Thermo Scientific Multiskan 公司)，SYBR Premix Ex Taq II(大连宝生物工程有限公司)。 1.2 实验动物与分组处理

健康纯系清洁级Sprague-Dawley大鼠24只(体重100~150 g)，由贵阳医学院动物实验中心提供，许可证号:SCXK(黔)2012-0001，经常规适应性饲养1周后随机分为3组，每组8只，雌雄各半。对照组大鼠饮用普通自来水(饮水氟含量＜1 mg/L)；低、高氟组大鼠分别饮用氟含量50、100 mg/L的NaF自来水,实验周期6个月。染氟结束后，收集大鼠尿液；股动脉放血处死动物，取一侧股骨上段10%中性福尔马林固定，取一侧股骨组织于-80 ℃保存，取胫腓骨液氮保存。 1.3 指标与方法 1.3.1 尿氟、骨氟水平测定

尿氟采用氟离子电极法，骨氟灰化后采用氟离子电极法。 1.3.2 骨组织形态学检查

取股骨组织经10%中性福尔马林固定，以10%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)在4 ℃恒温脱钙3周，常规石蜡包埋切片后苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)，每张切片选取骺板下0.5 cm部位，观察病理学变化，测量骨皮质厚度、骨小梁宽度、骨小梁密度、成骨细胞指数。 1.3.3 骨组织成骨细胞Notch通路蛋白表达测定

采用免疫组化法，石蜡切片常规脱蜡至水后，浸入乙二胺四乙酸抗原修复液(pH=8.0)后65 ℃恒温4 h，3%双氧水放置10 min，山羊血清37 ℃ 封闭20 min，滴加一抗湿盒中4 ℃过夜，其中兔抗Jag1抗体为1:400，兔抗RBPJ、Hes5抗体为1:500；按照PV-9001说明书操作，采用3,3′-二氨基联苯胺显色，苏木素复染后，脱水，透明，封片，光镜下观察。判断标准：Jag 1阳性细胞为细胞膜或细胞质中有黄色着色，RBPJ阳性细胞为细胞核中有黄色着色，Hes 5阳性细胞为细胞核或细胞质中有黄色着色。在400倍镜下随机选取5个视野，每个视野选取5个阳性区域计算平均光密度，平均光密度与蛋白表达水平呈正比。 1.3.4 骨组织Notch通路蛋白表达测定

采用免疫印迹法，将大鼠骨组织用液氮捣碎后，称取100 mg骨组织，加入1 mL RIPA裂解液(强)提取总蛋白，用二喹啉甲酸法测定蛋白浓度，取相同上样量进行聚丙烯凝胶电泳分离蛋白，再用转膜装置转于聚偏二氟乙烯莫(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上，分别用RBPJ抗体(1:5 000)和Jag1、Hes5抗体(1:1 000)4 ℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔lgG(1:2 000)37 ℃孵育1 h，化学发光试剂显色，凝胶成像系统曝光后，采用Image Lab软件分析，以β-actin为内参，以相对灰度值反映骨组织蛋白表达量。 1.3.5 骨组织RBPJ、Jag1和Hes5 mRNA表达测定

采用实时荧光定量法,将骨组织用液氮捣碎后，Trizol提取总RNA，按照逆转录试剂盒说明书合成cDNA，进行实时荧光定量反应，引物由上海生工生物工程股份有限公司设计并合成，反应结束后，计算2^-ΔCT进行比较。Jag1引物序列：上游5′-GAACTGGACAAACAAACAGGACAAC-3′,下游5′-CCTCAGACTGGGATACGACAACA-3′，产物大小163 bp；RBPJ引物序列：上游5′-GCGGTTTGTCTTTCTGGCTA-3′,下游5′-TGTTCGGAGTGGCATTTACA-3′，产物大小142 bp；Hes5引物序列：上游5′-TGCTCAGTCCCAAGGAGAAAAAT-3′,下游5′-GCTTTGCTGTGCTTCAGGTAG-3′，产物大小193 bp；三磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)引物序列：上游5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′,下游5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′，产物大小143 bp。PCR反应体系20 μL，其中SYBR^® Premix Ex TaqTM(2×)10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA模板 1 μL，加双蒸水补足20 μL，PCR设置条件Jag1、GAPDH为95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s；58 ℃ 30 s；72 ℃ 35 s；共40个循环。RBPJ、Hes 5为95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s；72 ℃ 35 s；共40循环。 1.4 统计分析

计量资料均采用x±s表示,采用SPSS 17.0软件进行统计分析，多组间均数比较采用方差分析,方差齐性采用最小显著差异法，方差不齐采用Games-Howell法,检验水准为α=0.05。 2 结 果 2.1 染氟对大鼠尿氟和骨氟含量影响(表 1)

与对照组比较，染氟组大鼠尿氟、骨氟含量均升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)，且高氟组尿氟含量高于低氟组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表 1

表 1 染氟对大鼠骨氟与尿氟含量影响(x±s，n=8) 组别(mg/L) 尿氟(mg/L) 骨氟(μg/g) 对照组 2.00±0.34 1 753.67±184.68 染氟组  50 11.80±1.08a 5 974.76±2 036.13a               100 18.08±1.13ab 7 996.51±2 669.93a 注：与对照组比较，a P<0.05；与50 mg/L染氟组比较，b P<0.05。

表 1 染氟对大鼠骨氟与尿氟含量影响(x±s，n=8)

HE染色光镜下可见对照组骨皮质厚度均匀，骨小梁宽度适中，排列有序(图 1 2a)；染氟组大鼠骨皮质增厚，骨小梁增生变粗，排列紊乱，骨小梁腔隙变小，成骨细胞数目增多，呈立方形或椭圆形等(图 1 2b、2c)。与对照组比较，染氟组大鼠骨皮质厚度、骨小梁宽度、骨小梁密度、成骨细胞指数均升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)(表 2)。

图 1

注：2a：对照组；2b：50 mg/L染氟组；2c：100 mg/L染氟组。 图 1 大鼠骨组织形态学改变(HE，×40)

表 2

表 2 染氟对大鼠骨组织形态学计量学影响(x±s，n=8) 组别(mg/L) 骨皮质厚度(μm) 骨小梁宽度(μm) 骨小梁密度(%) 成骨细胞指数(个/mm) 对照组 253.84±51.07 31.98±3.82 28.31±6.28 19.78±3.04 染氟组  50 329.58±32.24a 46.18±8.84a 49.01±5.39a 31.22±4.52a               100 363.29±40.10a 51.35±11.59a 54.67±4.59a 36.80±6.19a 注：与对照组比较，a P<0.05。

表 2 染氟对大鼠骨组织形态学计量学影响(x±s，n=8)

与对照组比较，高氟组大鼠骨组织中Jag1蛋白表达降低，低、高剂量染氟组大鼠RBPJ蛋白表达均升高、Hes5蛋白表达均降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)。

图 2

图 2 染氟对大鼠骨组织Jag 1、RBPJ、Hes 5蛋白表达影响

表 3

表 3 染氟对大鼠骨组织Notch通路蛋白表达影响(x±s，n=8) 组别(mg/L) Jag 1 RBPJ Hes 5 对照组 0.516±0.144 2.892±1.001 0.282±0.099 染氟组  50 0.475±0.189 4.985±0.913a 0.147±0.039a               100 0.112±0.024ab 4.279±1.507a 0.128±0.039a 注：与对照组比较，a P<0.05；与50 mg/L染氟组比较，b P<0.05。

表 3 染氟对大鼠骨组织Notch通路蛋白表达影响(x±s，n=8)

光镜观察显示，对照组大鼠成骨细胞Jag 1阳性表达数目较多，染色较深，而染氟组大鼠成骨细胞阳性表达数目较少，染色较浅；对照组大鼠成骨细胞RBPJ阳性表达数目较少，染色较浅，而染氟组阳性表达数目较多，染色较深；染氟组大鼠成骨细胞Hes5阳性表达较对照组数目和染色深浅上无明显变化。低、高氟组大鼠Jag1表达[分别为(0.024±0.008)、(0.029±0.009)]均低于对照组(0.044±0.023)，差异均有统计学意义(均P<0.05)；低、高氟组大鼠RBPJ表达水平[分别为(0.032±0.017)、(0.033±0.017)]均高于对照组(0.021±0.013)，差异均有统计学意义(均P<0.05)。 2.5 染氟对大鼠骨组织Notch通路因子 mRNA表达影响(表 4)

高氟组大鼠骨组织Jag1 mRNA相对表达量均低于对照组和低氟组，差异均有统计学意义(均P<0.05)；染氟组大鼠RBPJ mRNA相对表达量均低于对照组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。

表 4

表 4 染氟大鼠骨组织Notch通路因子mRNA表达影响(x±s，n=8) 组别(mg/L) Jag 1 RBPJ Hes 5 对照组 0.008 7±0.005 9 0.012 2±0.005 9 0.002 0±0.001 5 染氟组  50 0.006 6±0.006 0 0.005 8±0.003 7a 0.005 7±0.004 1               100 0.005 7±0.005 4ab 0.005 5±0.004 4a 0.005 5±0.004 8 注：与对照组比较，a P<0.05；与50 mg/L染氟组比较，b P<0.05。

表 4 染氟大鼠骨组织Notch通路因子mRNA表达影响(x±s，n=8)

研究表明氟骨症的发生与骨组织信号通路相关，氟可以通过刺激Wnt经典信号使成骨作用增强,从而引起骨骼病变发生氟骨症^[2]，慢性氟中毒可引起股骨成骨细胞中特异性转录因子osterix表达改变，导致骨骼损伤^[3]，Notch通路与骨形成和发育有关^[4]。Notch通路包括CBF-1/RBPJ依赖途径和CBF-1/RBPJ非依赖途径，前者称为Notch经典途径，其受体目前发现4种，即Notch1、2、3、4,而配体包括DLL 1、3、4和Jagged 1、2。Notch受体与配体结合后，释放胞内段(notch1 intracellular domain,NICD),NICD进入核内与CBF-1/RBPJ结合，CBF-1/RBPJ本身为转录抑制因子，CBF-1/RBPJ与NICD结合后转化为转录激活因子，激活靶基因如Hes 1、Hes 5、Hey 1、Hey 2、Hey L等^[5]。

Jag 1作为Notch通路重要配体之一，与骨组织形成和发育密切相关。研究发现一种常表现为心血管缺陷，颅面骨及脊椎骨畸形的常染色体显性遗传病—阿拉吉欧综合征被认为与Jag 1基因的突变有关^[6]，Engin等^[7]发现在人骨肉瘤组织中Jag 1表达量异常升高；Dishowitz等^[8]研究表明Jag 1可以介导间充质干细胞向成骨细胞分化并导致矿化出现；王胜朝等^[9]发现Jag 1在骨髓基质细胞Kusa-A1成骨分化过程中表达大幅下调。本研究结果表明，染氟组大鼠骨组织和成骨细胞中Jag 1蛋白表达量降低，高氟组骨组织Jag 1 mRNA表达水平明显下调。提示高氟可以在蛋白和mRNA水平抑制Jag 1表达，促进成骨分化，导致骨硬化。

RBPJ作为Notch经典通路核心因子，只有当其被激活后才能将Notch通路的信号向下游传导，发挥作用。研究表明RBPJ/CBF1升高有利于促进Kusa-A1的成骨分化^[10]，RBPJ作为一个负性调控因子抑制破骨细胞的分化及成熟^[11]。本研究结果显示，染氟组大鼠骨组织中RBPJ蛋白水平升高，并出现骨皮质增厚、骨小梁变粗、骨小梁腔隙变小等骨硬化表现。推测氟可能促进RBPJ蛋白表达，增加对下游靶基因的抑制作用，使成骨细胞增殖、分化加快，大于破骨代谢,骨动态平衡被打破，从而出现骨硬化表现。

Hes家族基因由多个因子构成，目前证明Hes 1、Hes 5、Hes 7是依赖Notch信号通路的下游靶基因，而Hes 5参与骨形成与重建，软骨分化过程中Hes 5表达量下降，抑制Hes 5的表达有利于软骨细胞增殖^[12]，另外在骨关节炎中可观察到大量Hes 5表达^[13]。本研究结果显示，Hes 5在氟中毒大鼠骨组织中蛋白表达降低。提示高氟使Notch通路信号分子受抑制，从而加快软骨内成骨过程，导致骨形成与重建过程加快。