氯乙烯(vinyl chloride monomer，VCM)是一种重要的化工原料，广泛用于合成聚氯乙烯。上世纪70年代美国首次报道职业接触VCM可引起人肝血管肉瘤(angiosarcoma of liver,ASL)^[1]。研究表明空气中VCM浓度＞14 mg/m³可导致DNA损伤^[2]。DNA损伤修复基因和细胞周期调控基因多态与VCM致染色体损伤有关^[3]。而细胞周期调控异常是肿瘤发生的一个重要因素。主要表现在细胞周期分布时相的变化和相关因子-细胞周期蛋白(cyclins)、细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin dependent kinases,CDKs)及其抑制剂(cyclin dependent kinase inhibitors,CKIs)表达异常，从而导致细胞恶性增殖。细胞周期关卡可被遗传毒物启动，从而使细胞周期发生阻滞。VCM能够造成DNA损伤，受损的细胞，首先会停滞于G₁期，进行DNA修复。P16蛋白是G₁/S关卡负调控的重要组成部分，与cyclin D1竞争cyclin dependent kinase 4(CDK 4)，从而抑制cyclin D1-CDK 4复合物的形成与活性，而当P16蛋白表达异常时，cyclinD1则与CDK 4优势结合，使细胞生长失去控制，进而导致细胞的恶性变化^{[4, 5, 6]}。本研究通过观察VCM所致DNA损伤时G₁/S关卡相关调控因子表达水平变化，探讨VCM对G₁/S关卡功能影响，为揭示VCM可能的致癌机制提供理论依据，结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器

VCM气体(太原化学股份有限公司氯碱分公司)，纯度＞99.99%；人正常肝细胞HL-7702(中国科学院上海细胞库)；蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物科技研究所)；二甲基亚砜、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)、四甲基二乙胺(美国Sigma公司)；兔抗人P16抗体(一抗)(美国Abcam公司)；鼠抗人cyclin D1抗体(一抗)(美国CST公司)；鼠抗人CDK 4抗体(一抗)、鼠抗人β-肌动蛋白抗体(内参抗体)、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(二抗)、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG(二抗)、ECL超敏发光液(武汉博士德生物工程有限公司)。倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)、低温高速离心机(湖南星科科学仪器有限公司)、DYY-10型三恒电泳仪(北京市六一仪器厂)、DYCZ-24DN型电泳槽(北京君意东方电泳设备有限公司)、流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)。 1.2 细胞培养

人正常肝细胞HL-7702采用常规传代培养，用配置好的改良杜氏伊格尔培养基(Dulbecco's modified eagle medium，DMEM)于37 ℃、5% CO₂条件下培养；当细胞贴壁后，生长铺展面积占培养瓶底面积80%左右进行传代，按1：3比例传代后，继续培养，1~2 d换液，每天用倒置显微镜观察细胞生长情况，取生长状态良好的对数生长期细胞进行试验。 1.3 细胞分组与处理

参照Chiang等^[7]染毒方法，将处于对数生长期细胞按1.25~1.75×10⁷个密度传至250 mL玻璃培养瓶中，待细胞贴壁生长稳定后，弃掉旧培养基，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)清洗细胞后加入50 mL新鲜培养基，再加入用以维持pH值的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES]20 mmol/L，从每个瓶中抽出一定体积气体(分别为0.8%、 2.5%、 7.5%、 15.0%和30.0%，即1.6、5.0、15.0、30.0、60.0 mL)，再将相应体积的VCM气体注入玻璃培养瓶，对照组为瓶中已有的空气。将培养瓶放在37 ℃培养箱中连续染毒48 h，轻轻晃动培养瓶，每个剂量组设3个平行样。 1.4 指标与方法 1.4.1 细胞周期检测

将染毒后细胞用0.25%胰酶在37 ℃条件下消化，终止消化后于1 000 r/min离心4 min，弃大部分上清，将细胞弹起重悬，加4~5 mL PBS，重复清洗离心细胞2次，向单细胞悬液中快速注入2 mL 70％预冷乙醇固定；4 ℃冰箱保存过夜。染色前800 r/min 离心5 min，弃去乙醇，再加PBS(细胞悬液用300目筛网过滤1次)；加入400 μL PI染料混匀，室温避光30 min。上机检测。 1.4.2 细胞G₁/S关卡相关蛋白表达检测

采用Western blot法，用蛋白浓度测定试剂盒利用标准曲线计算样品蛋白含量，用蛋白裂解液将样品稀释成同一浓度，经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭后，弃封闭液，分别加兔抗人P16蛋白抗体、鼠抗人cyclin D1蛋白抗体、和兔抗人CDK 4蛋白抗体及鼠抗人β-肌动蛋白抗体稀释液(用2%抗体稀释液稀释，稀释比例为P16为 1：1 000，cyclin D1为 1：2 000，CDK 4 为1：500，β-actin为 1：1 000)，于4 ℃冰箱孵育过夜；回收一抗稀释液，用TBST缓冲液洗膜，20 min×3次；加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗体和羊抗鼠IgG稀释液(用2%抗体稀释液，稀释比例均为1：3 000)，室温孵育2 h；回收二抗稀释液，用TBST洗膜，20 min×3次；用化学发光试剂盒进行化学发光显影，清水清洗底片，晾干后扫描至电脑中；利用Quantity One软件分析条带光密度值，将目的条带与内参β-actin光密度值比值作为目的蛋白的相对表达量。各组设3个平行样。 1.5 统计分析

数据以x±s表示，采用SPSS 16.0软件进行统计分析，定量资料采用单因素方差分析，两两比较用最小显著差数法，检验水准为α=0.05。 2 结 果 2.1 VCM对HL-7702细胞形态学影响(图 1)

倒置显微镜下观察可见HL-7702细胞成不规则形，大小不等，贴壁牢；VCM染毒48 h后，与对照组比较，各剂量VCM染毒组HL-7702细胞形态改变不明显，但是贴壁生长的细胞数目减少，培养液中死细胞增多。

图 1

注：A：对照组；B、C、D、E、F：分别为0.8%、2.5%、7.5%、15.0%、30.0% VCM组。 图 1 VCM染毒致HL-7702细胞形态学变化(×400)

当VCM剂量＜7.5%时，HL-7702细胞G₀/G₁期细胞百分数随染毒剂量增加呈上升趋势；与对照组比较，7.5%剂量组HL-7702细胞G₀/G₁期细胞百分数明显升高，差异有统计学意义(P＜0.01)，2.5%剂量组HL-7702细胞S期细胞百分比下降，差异有统计学意义(P＜0.05)；各组HL-7702细胞G₂/M期细胞百分比差异无统计学意义(P>0.05)。

表 1

表 1 VCM对HL-7702细胞周期影响(x±s，%) 组别(%) G0/G1期 S期 G2/M期 对照组 73.35±1.56 12.85±0.02 13.81±1.59 氯乙烯  0.8 73.55±1.22 12.77±2.23 13.69±1.01               2.5 76.84±0.21 10.97±0.17a 12.20±0.38               7.5 78.52±4.46b 11.12±1.01 10.37±3.45               15.0 74.80±1.40 13.13±0.78 12.08±0.62               30.0 72.29±3.12 14.23±1.48 13.50±1.65 注：与对照组比较，a P＜0.05；b P＜0.01。

表 1 VCM对HL-7702细胞周期影响(x±s，%)

电泳结果显示，各组均在相对分子质量为43 kD处检测到内参蛋白β-actin，在相对分子质量为16 kD处检测到P16蛋白条带；在相对分子量为33 kD处检测到CDK 4蛋白条带，在相对分子量为36 kD处检测到cyclin D1蛋白条带。在VCM＜7.5%剂量时，随着VCM浓度增加，P16蛋白表达量呈上升趋势，7.5%剂量组P16蛋白表达高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)；在VCM＜15.0%剂量时，随着VCM浓度增加，CDK 4蛋白表达量呈上升趋势，7.5%剂量组HL-7702细胞中CDK 4蛋白表达高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)；cyclin D1蛋白表达在各组间差异无统计学意义(P>0.05)。

表 2

表 2 VCM对HL-7702细胞P16、CDK 4、cyclin D1蛋白表达影响(x±s) 组别(%) P16 CDK 4 cyclin D1 对照组 0.40±0.27 0.83±0.18 0.77±0.52 氯乙烯  0.8 0.40±0.17 0.98±0.37 0.83±0.35               2.5 0.50±0.23 0.98±0.34 0.89±0.47               7.5 0.80±0.30a 1.43±0.51a 0.74±0.23               15.0 0.53±0.18 1.20±0.49 0.73±0.13               30.0 0.59±0.35 1.10±0.64 1.11±0.43 注：与对照组比较，a P＜0.05。

表 2 VCM对HL-7702细胞P16、CDK 4、cyclin D1蛋白表达影响(x±s)

细胞周期是细胞生命活动的基本过程，细胞在周期时相变迁中进入增殖、分化、衰老和死亡等生理状态。细胞在细胞周期中依次经过G₁期、S期、G₂期和M期，细胞周期的失调与肿瘤的发生密切相关。在细胞周期调控过程中，存在3个关键期，即G₁/S、G₂/M和纺锤体组装期，其中G₁/S期之间的调控点是对细胞增殖进行调控的关键点^[8]。本研究结果显示，在<15.0%剂量时，随着VCM染毒剂量增加，G₀/G₁期细胞所占比例升高，S期细胞比例下降，出现G₁期阻滞；15.0%、30.0%VCM组G₀/G₁ 期细胞百分数减少，S期细胞百分数相应增多。提示VCM致DNA损伤时，在低剂量时可使细胞发生G₁期阻滞，进行DNA损伤的修复，进入S期的细胞减少，在G₁/S关卡延缓了细胞周期，随着染毒剂量增加，VCM所致的遗传物质损伤严重，一方面一些损伤严重的细胞无法修复，引起凋亡；另一方面，VCM可能导致G₁/S期功能减弱，受损细胞可以越过G₁/S期进入S期。

细胞周期调控因子有3类：cyclin、CDKs和CKIs，其中CDKs是调控网络的核心，cyclins对CDKs具有正性调控作用，CKIs有负性调控作用，共同构成细胞周期调控的分子基础。细胞周期运转过程是通过cyclin-CDKs复合物来实现的，CKI可以和CDK或cyclin-CDKs复合物结合，通过抑制CDK活性调节细胞周期运转。细胞周期的正常运转需要CDK的正性调控因子与负性调控因子的精确协同与平衡。一旦这种平衡失调就会造成细胞的失控性增殖而发生癌变^[9]。P16作为细胞周期调控抑制因子，可以与cyclin D1竞争性结合CDK 4(CDK 6)，阻止cyclin D1与CDK 4(CDK 6)结合，抑制其复合物的蛋白激酶活性，使细胞不能由G₁期进入S期，从而阻止细胞增生。当P16蛋白表达降低或缺失时，细胞可无限制通过G₁期，从而引起细胞恶性增殖导致肿瘤发生^{[10, 11]}。本研究结果显示，在低剂量范围内，染毒组HL-7702细胞内P16蛋白表达量随着VCM染毒剂量升高呈上升趋势，当VCM浓度为7.5%时，P16蛋白表达量达顶峰，之后随染毒剂量增加而下降。提示低剂量时的G₁期阻滞可能主要由P16发挥其负性调控作用完成，随着染毒剂量增加(＞7.5%时)，P16蛋白表达下降，无法正常负性调节CDKs活性，负性调控作用减弱，G₁期阻滞消失，细胞增殖加快。

CDK 4、cyclin D1是细胞周期G₁期重要的调控蛋白，在G₁期cyclin D1通过结合并激活CDK 4或CDK 6，从而引起底物Rb蛋白磷酸化，磷酸化的Rb蛋白释放与之结合的转录因子，使DNA开始合成，促使细胞由G₁期进入S期，推动细胞周期进程。CDK 4表达升高对细胞正性调控作用增强，加快细胞周期进程。cyclin D1的过度表达导致G₁期缩短，使细胞过度增殖，最终导致细胞增殖失控，促进肿瘤的发生^{[12, 13]}。本研究结果显示，VCM对cyclin D1蛋白表达无明显影响，而CDK 4蛋白表达量在7.5%剂量组明显增多，这种细胞周期的正性调控作用被负性调控蛋白P16所抑制，因此表现为G₁期阻滞。