急性呼吸道感染造成儿童发病和死亡的主病因之一，每年全球因急性呼吸道感染而死亡儿童的病例约140万人^{[1, 2]}。引起呼吸道感染的有细菌、病毒和真菌，其中HBoV是新近发现的呼吸道感染的新型病毒，由瑞典Allander等^[3]于2005年从小儿呼吸道分泌物中分离到，文献报道博卡病毒是即呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)、鼻病毒(human rhinovirus，HRV)之后的第3个最常见的呼吸道病毒^[4]。四川成都地区有关HBoV在儿童中感染情况报道很少，本研究通过采集2009年10月—2013年10月成都地区急性呼吸道感染住院患儿的鼻咽抽提物，进行HBoV核酸检测，旨在了解HBoV流行状况及混合感染情况。

以成都市妇女儿童医院作为发热呼吸道症候群监测的哨点医院，收集从2009年10月—2013年10月因急性呼吸道感染而住院的病例1 842例，年龄≤14岁，有发热或白细胞异常、寒战等急性感染表现，并伴有咳嗽或咽部不适、流涕等呼吸道症状，采集鼻咽抽提物，并记录患儿的基本资料，其中包括：个人信息、临床表现、标本信息、实验室检查结果。标本保存和运输方法按临床检验操作规程进行。

iScriptTM cDNA Synthesis kit(美国BIO-RAD公司)，Taq DNA聚合酶和Mix(北京天根生化科技有限公司)，病毒核酸提取试剂盒(Viral Nucleic Acid Extraction KitⅡ)(北京Geneaid公司)，引物由上海Invitrogen公司合成，C1000 Touch Thermal Cycler PCR仪(美国BIO-RAD公司)。

将采集到的标本一式2份，一份加入50 μL甘油混匀后作为留样标本放入-80 ℃保存。另一份标本如果抽提物较为粘稠，按1:1体积加入1%pH 为7.6的胰蛋白酶，37 ℃消化1 h，离心后再提取核酸；如果比较清澈可以直接提取核酸。

取200 μL上述消化液(痰液)按照(Viral Nucleic Acid Extraction kit VR100)试剂盒说明书提取病毒核酸，再以核酸为模板，用巢式PCR扩增VP1/VP2基因，引物设计参考文献^[5]，引物P1：5′-CGCCGTGGCTCCTGCTCT-3′；引物P2：5′-TGTTCGCCATCACAAAAGATGTG-3′；引物P3：5′-GGCTCCTGCTCTAGGAAATAAAG AG-3′；引物P45-CCTGCTGTTAGGTCGTTGTTGTATGT-3′。反应体系为模板2 μL，引物0.4 μL，Mix 10 μL，Taq DNA酶0.4 μL，无RNase水 6.8 μL。94 ℃预变性4 min，先进行10个循环扩增(94 ℃ 35 s，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min)每个循环降0.5 ℃，再进行30个循环扩增(94 ℃ 30 s，54 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s)，72 ℃延伸10 min，第一轮与第二轮的PCR扩增程序相同。

痰液标本在进行博卡病毒检测同时，使用普通PCR也进行腺病毒(adenovirus,ADV)检测。此外利用iScript^TM cDNA Synthesis kit将所提取核酸中RNA逆转录成cDNA，再采用巢式PCR进行流感病毒(influenza virus，IFV)(A型、B型、C型)、呼吸道合胞病毒RSV(A型、B型)、副流感病毒(parainfluenza virus，PIV)(1-4型)的检测；采用普通PCR对人偏肺病毒(human metapneumovirus，HMPV)、人冠状病毒(human coronavirus，HCoV)进行检测。检测标本是否存在双重及多重感染。

采用SPSS 13.0软件进行描述性分析，其中率的比较采用行×列表的卡方检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

共收集1 842份鼻咽抽提物，其中男童1 093例，女童749例。HBoV的阳性标本为126例，总检出率6.84%(126/1 842)。男性检出率为7.60%(83/1 093)，女性检出率为5.74%(43/749)，两组进行比较差异无统计学意义(χ²=2.39，P>0.05)。不同年龄段HBoV的检出率不同，其中0~2岁患儿检出率最高为7.83%(108/1 379)，>2岁患儿博卡病毒检出率为3.89%(18/463)。

HBoV感染全年均有检出，根据四川地区气候特点，将3~5月为春季，6~8月为夏季，9~11月为秋季，12~翌年2月为冬季^[6]。由图 1可得出，每年博卡病毒流行的强度、时间长短都存在一定波动性，未见明显季节性特点，与其他3个季节相比冬季检出率非常低。此外，2012年博卡病毒检出率最高，夏季出现2个小流行高峰，其中八月份是历年监测检出率最高的，为58.82%。

图 1

Fig. 1

图 1 2009—2013年HBoV阳性患儿季节分布图

在126份阳性标本中，HBoV单纯感染有52例(41.27%)，混合感染有74例，位于前3位的分别是：与副流感病毒混合感染为27例，占总阳性标本21.43%；与呼吸道合胞病毒混合感染为18例；与鼻病毒混合感染也为18例，后两者都占总阳性标本的14.29%。

HBoV感染的阳性患儿临床表现主要为咳嗽、咳痰、流涕、呼吸急促、呼吸困难、肺部干湿性罗音，除了有呼吸道的症状之外，还有发热、腹痛、腹泻、肌肉酸痛等症状。126例HBoV感染阳性患儿的临床诊断结果如下：下呼吸道感染共有100例，占总阳性的79.37%，其中新生儿肺炎有24例(19.05%)，支气管肺炎有47例(37.3%)，支气管炎有8例(6.35%)，重症肺炎有4例(3.17%);急性上呼吸道感染共有8例(6.35%)，确诊为急性化脓性扁桃体炎有1例(0.79%)，急性喉炎有2例(1.59%)。

自2005年瑞典科学家Allander及其同事运用分子病毒的筛查方法发现新型病毒并将其命名为博卡病毒以来，北美、澳洲、亚洲、欧洲等许多陆续有博卡病毒感染的报道，可见博卡病毒感染已成全球性分布^{[4, 7, 8]}。2006年我国科学家利用DNA检验技术，在湖南省郴州市第一人民医院因急性呼吸道感染住院的患儿鼻咽抽吸物标本中首次检测出人博卡病毒^[9]，此后，浙江、北京、广东、重庆等地区相继检出人博卡病毒，2008年我国已将人博卡病毒正式纳入发热呼吸道症候群病毒中必检项目。成都某妇女儿童医院作为监测的哨点医院，自2009年10月份以来，已采集1 842份儿童鼻咽抽提物标本，其中有126份为HBoV阳性标本，检出率为6.84%，其他文献报道HBoV在呼吸道标本检出率为0～10.7%不等^{[10, 11, 12, 13]}，可能原因如不同地区所采集的标本量不同，气候差异,检测方法不同等。作为与人类急性呼吸道感染密切相关的新型病毒，人博卡病毒可以通过空气传播，由于儿童抵抗力偏弱所以容易引起儿童呼吸道感染，其中下呼吸道感染更为常见，在本次研究中，博卡病毒阳性患儿为下呼吸道感染的占79.37%(100/126)。在下呼吸道感染的患儿中排列前三位的病症分别是：支气管肺炎、新生儿肺炎和支气管炎；博卡病毒阳性的患儿除了有呼吸道症状以外，还有部分患儿出现腹泻、腹痛、腹胀等胃肠道症状。博卡病毒阳性患儿高发人群多在2岁以内，其检出率(7.83%)明显高于2岁以上儿童的检出率(3.89%)，与其他文献报道一致^{[13, 14]}。本次研究还发现，博卡病毒在感染男生和女生患儿中，检出率基本上一致无统计学差异。此外，发现博卡病毒在四川省流行趋势变化大，未见明显季节性特点，且冬季博卡病毒的检出率很低，这可能与成都特殊的地理位置、气候特点及在冬季的采样量有所下降有关。

作为呼吸道感染主要病原体之一，博卡病毒与其他呼吸道病毒有较高的混合感染^{[7, 11]}，本次研究发现得出博卡病毒混合感染率为58.73%，也支持上述观点，这给我们了解博卡病毒的致病机制和机体感染后免疫情况带来一定的困难。因此还要强化对博卡病毒的监测力度，加大对博卡病毒的进化分析，以及呼吸道病原谱分析，并建立博卡病毒成熟的体外培养和动物模型实验，研制博卡病毒的疫苗，对疾病的防控有才更有意义。