东北酸菜是东北地区标志性的发酵食品，具有开胃提神、去油解腻的功效，能增加食欲、助消化，深受老百姓的欢迎。其中有机酸正是形成酸菜这种特色风味的物质基础^[1]。酸菜中含有多种有机酸，有机酸含量的高低和组成，是确定酸菜品质优劣的重要指标^[2]，但是目前对于酸菜的研究多偏重于进行危害物分析，如亚硝酸盐^[3]、重金属等^[4]。对于酸菜中有机酸含量测定的文献较少，因此，本研究建立反相高效液相色谱法同时测定酸菜中的6种有机酸成分，对乳酸菌接种发酵法和自然发酵法生产酸菜发酵过程中有机酸含量的变化情况进行对比，探讨其变化规律，为获得优质酸菜提供参考依据。

有机白菜(购自沈阳市皇姑区乐购超市)；嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus，中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号1.2467)；草酸标准品(含量≥99.5%，)、醋酸标准品(含量≥99.8%)、柠檬酸标准品(含量≥99.5%)、乳酸标准品(含量≥99.8%)、琥珀酸标准品(含量≥99.5%)、富马酸标准品(含量≥99.5%)、柠檬酸标准品(含量≥99.5%)(均为美国Sigma公司产品)；强酸型阳离子交换树脂(D072型，中国南大化工制品有限公司)；水为超纯水(电阻率为18.2 MΩ·cm)；其他试剂均为分析纯。Agilent 1200型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；KQ-250超声波清洗器(中国昆山市超声仪器有限公司)；电子分析天平(瑞士 METTLER-TOLEDO公司)；Milli-Q超纯水机(Integral 15型，美国millipore公司)；发酵箱(tupperware 25L，特百惠中国有限公司)。

将白菜除杂整理清洗沥干，超过1 000 g的白菜纵向切分成不超过1 000 g的小块，按头尾相对的方式层层摆入发酵箱中，注入1.5%的氯化钠溶液没过白菜，压实，充氮去除液面上层空气中的氧气，控温20 ℃密封发酵，进行自然发酵法生产酸菜的试验。接种发酵法在自然发酵法的基础上将嗜酸乳杆菌用生理盐水洗涤2~3次，再用等量的新鲜1.5%氯化钠溶液重新悬浮，接种入酸菜发酵箱中，混合均匀，接种量为不低于108 CFU/mL。分别在0、3、5、7、9、11、15、20、25、35、45 d 进行取样分析，观察有机酸的变化趋势，并比较2种不同发酵方式所生产的酸菜中有机酸的变化情况。

色谱条件：色谱柱：Agilent C₁₈ (5 μm，250×4.6 mm)；流动相：0.05% H₃PO₄，甲醇(90:10)；检测波长：210 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：10 μL。样品处理方法：取卤汁10 mL以1 mol/L 盐酸溶液调pH值至1~2，加入1%磷钨酸沉淀蛋白质，8 000 r/min离心5 min，上清液恒速泵入离子交换柱中，控制上液速度不超过1 mL/min，后以0.05% H₃PO₄洗脱，洗脱液定容至100 mL。标准曲线制作：有机酸类成分采用外标法定量，分别将乳酸、醋酸、草酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸标准品配制成1 mg/mL的标准品溶液，再稀释成含1、5、20、40、80、120 mg/L的混合标准品溶液，注入液相分析，以峰面积(A)为横坐标，浓度C(mg/L)为纵坐标，绘制标准曲线方程。

采用SPSS 13.0软件进行描述性统计分析。

自然发酵法和乳酸菌发酵法生产酸菜过程中有机酸类成分的典型色谱图中草酸、乳酸、醋酸、富马酸、琥珀酸和柠檬酸的保留时间分别为2.51、4.26、4.81、5.72 、6.19 和7.01 min。

6种有机酸的标准曲线方程、线性范围和检出限见表 1；加标回收实验结果见表 2。

表 1

表 1 标准曲线方程、线性范围和检出限 序号 品名 标准曲线方程 线性范围 (mg/L) 相关 系数 检出限 (mg/L) 1 乳酸 y=0.28x+0.44 4.95~113.64 0.999 5 0.1 2 醋酸 y=0.64x+0.03 5.01~120.97 0.999 8 0.1 3 柠檬酸 y=0.33 x-0.04 5.05~120.77 0.999 9 0.1 4 草酸 y=6.31 x+1.08 5.01~118.35 0.999 9 0.1 5 琥珀酸 y=0.79x+0.14 4.97~116.62 0.999 8 0.1 6 富马酸 y=0.24x+0.05 4.97~116.54 0.999 7 0.1

表 1 标准曲线方程、线性范围和检出限

表 2

表 2 加标回收率实验结果 序号 品名 加标量 (mg) 测定值 (扣除原量mg) 回收率 (%) RSD (%) 1 乳酸 0.300 0 0.289 9 0.450 0 0.442 7 98.16 1.46 2 醋酸 0.210 0 0.201 2 0.420 0 0.410 8 0.640 0 0.631 9 97.45 1.53 3 柠檬酸 0.120 0 0.117 7 0.240 0 0.239 0 0.360 0 0.352 8 98.56 0.90 4 草酸 0.230 0 0.224 8 0.460 0 0.452 0 0.690 0 0.665 4 97.48 0.96 5 琥珀酸 0.180 0 0.175 3 0.360 0 0.354 2 0.540 0 0.521 1 97.43 0.97 6 富马酸 0.150 0 0.146 5 0.300 0 0.299 2 0.450 0 0.439 6 98.36 1.21

表 2 加标回收率实验结果

表 3

表 3 精密度实验(RSD%) 项目 草酸 乳酸 醋酸 富马酸 琥珀酸 柠檬酸 标准品 0.49 0.51 0.38 0.09 0.18 0.51 样品溶液 2.45 2.01 1.78 2.76 3.12 2.87

表 3 精密度实验(RSD%)

接种发酵产品中主要呈味有机酸中乳酸、醋酸、草酸的含量高于自然发酵的产品，而柠檬酸在二者中无明显区别。自然发酵产品中未产生琥珀酸，接种发酵产品中含有少量的琥珀酸。2种发酵方法生产的酸菜中均无富马酸。接种发酵法生产的酸菜中总酸含量也略高于自然发酵生产的酸菜。

图 1

图 1 自然发酵法和乳酸菌接种发酵法生产酸菜有机酸含量变化图

由图 1可知，酸菜中总有机酸含量自然发酵法与接种发酵法相差不大，但其中乳酸的含量差异明显，自然发酵法中乳酸占总酸的百分含量为58.99%，而接种发酵法中为70.71%。由于乳酸为酸菜功效的主要指标成分，并有明确的生理作用。采用有机酸中乳酸百分比较高的生产工艺可提高产品质量，这一点上接种法优于自然发酵法。柠檬酸具有温和、爽快和新鲜感的酸味，可产生爽口的感觉，自然发酵法中柠檬酸的百分比为8.21%，接种法中柠檬酸占11.51%，另外乳酸菌接种发酵法生产的酸菜中还有少量琥珀酸产生，而自然发酵法生产的没有。

结合文献资料^[2]对草酸、乳酸、醋酸、富马酸、琥珀酸和柠檬酸等6种有机酸进行监测分析^{[5, 6, 7, 8]}，这6种有机酸的酸味特征是：柠檬酸具有温和、爽快和新鲜感的酸味，乳酸酸味尖利、稍有涩感，琥珀酸具有酸鲜味，草酸和醋酸带有刺激性，富马酸具有独特的酸味，酸味强度较高，是柠檬酸的1.8倍。这基本涵盖了酸菜腌制过程中可能出现的酸味变化。对这6种有机酸的分析具有一定的代表性^{[9, 10]}。

本研究所建立的反相高效液相色谱法测定酸菜中有机酸的方法简便、快速、灵敏、准确，适用性良好，对酸菜中的6种有机酸能有效地进行同时测定，6种有机酸的标准曲线方程、线性范围、回收率及重复性均符合测定要求。

自然发酵法与接种发酵法生产所酸菜中总有机酸含量相差不大，但其中接种发酵法生产的酸菜中乳酸的含量大于自然发酵法，且发酵法酸菜的乳酸含量早于自然发酵法的达到较高水平。由于乳酸为酸菜功效的主要指标成分，并有明确的生理作用。采用有机酸中乳酸百分比较高的生产工艺可提高产品质量，这一点上接种法优于自然发酵法。柠檬酸具有温和、爽快和新鲜感的酸味，可产生爽口的感觉，接种法中柠檬酸高于自然发酵法中柠檬酸，另外乳酸菌接种发酵法生产的酸菜中还有少量琥珀酸产生，而自然发酵法生产的没有，而且基于以上试验数据可知，利用乳酸菌接种发酵法生产酸菜可获得质量更好，而且生产周期更短，具有较好的应用价值。