心肌缺血/再灌注损伤主要表现为患者发生心肌缺血，冠状动脉再通，心肌恢复灌注后导致的心肌损伤性反应，发生机制复杂。研究显示，氧化应激、缺血缺氧及再灌注损伤等容易导致心肌细胞坏死，并进一步引发患者心肌细胞凋亡，而细胞凋亡的发生与信号通路介导的一系列程序密切相关^[1]。因此通过某种方式阻断信号通路，可有效预防或减少细胞凋亡发生，改善患者心功能。研究表明栀子苷为环烯醚萜苷类化合物，具有抗炎、抗氧化应激等功效^[2]。本研究采用大鼠建立心肌缺血再灌注损伤模型，观察栀子苷对心肌缺血再灌注损伤的保护作用,并从抗氧化损伤、抗细胞凋亡等角度探讨作用机制，结果报告如下。

健康Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，specific pathogen free(SPF) 级，雌雄各半，体重(250±320)g(河南省实验动物中心)，实验动物生产许可证号：SCXK(豫)2010－0002。在温度(25±2)℃，相对湿度(50±5)% ，光照时间为12 h，适应性喂养1周后进行试验，自由进食及饮水。

栀子苷(批号110749，中国药品生物制品检定所)；乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase，LDH)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；末端脱氧核苷酸转移酶介导 dUTP 缺口末端标记法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL)细胞调亡检测盒(武汉博士德生物有限公司)；β-actin、兔抗鼠Bcl-2、Bax、p53抗体(美国Sigma公司)。HX-300 动物人工呼吸机(成都泰盟科技有限公司)；BT224S 电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；计算机图像分析系统(重庆大学自动化研究所)；CF-5型低温高速离心机(日本Hitachi公司)；显微镜(日本Olympus公司)。

60只大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组、栀子苷低、中、高剂量组(25、50、100 mg/kg)、阳性对照组(通心络胶囊，100 mg/kg)，每组10只；栀子苷组与阳性对照组大鼠于术前灌胃给药，1次/d，连续7 d,假手术组和缺血再灌注组大鼠给予等体积蒸馏水。

大鼠采用戊巴比妥钠(45 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰位固定，气管插管，接人工呼吸机(潮气量：20 mL，呼吸频率：70 次/min，呼吸时比1：1)；左侧第4肋间胸壁剪开，心脏暴露，剪开心包膜，暴露心肌，除假手术组外，其余各组大鼠结扎左冠状动脉前降支，以II导联心电图ST 段抬高0.1 mV 或T 波高耸、心肌暗红色为结扎成功；结扎30 min松开再灌注24 h，以抬高的ST 段下降1/2为再灌注复制成功。

大鼠心肌缺血/再灌注24 h 后，腹主动脉取血，3 000 r/min离心10 min，取上清液，－20 ℃冻存备用。取出大鼠心脏置于冰上，取缺血部位心肌组织，称重，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)冲洗，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，并常规切片(部分用于心肌细胞凋亡检测)，苏木精-伊红染色法 (hematoxylin-eosin staining，HE)染色，光镜观察心肌细胞病理变化；取部分心肌组织制成10 %组织匀浆，-20 ℃冻存备用。

取血清，化学比色法测定LDH活性，硫代巴比妥酸比色法测定心肌组织中MDA含量，黄嘌呤氧化酶法测定心肌组织中SOD活性；无机磷法测定心肌组织中Ca²⁺-ATPase活性。

采用TUNEL法，各组取5张切片，脱氧核糖核酸酶(10 μg/mL)消化处理为阳性对照，未消化处理为阴性对照，计数凋亡细胞和细胞总数，计算细胞凋亡指数，细胞凋亡指数(%)=凋亡细胞总数/总细胞数× 100%。

采用常规方法提取心肌组织蛋白，Western blot 检测胞浆内P⁵³、Bcl-2、Bax蛋白表达，采用凝聚成像系统扫描，并采用 Quality one 软件进行灰度分析，计算蛋白相对表达水平。

计量资料以x±s表示，采用 SPSS 15.0进行统计分析，组间比较采用单因素重复测量资料方差分析，组间两两比较采用Student-Newman-Keuls(SNK)q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

假手术组大鼠心肌细胞界限较清晰，肌纤维和细胞排列整齐，细胞大小和结构比较正常(图 1A)；缺血再灌注组大鼠心肌细胞明显肿胀，细胞核不规则，细胞界限不清晰，间隙增大，胞浆染色深浅不一，心肌纤维存在中性粒细胞浸润(图 1B)；阳性对照组大鼠心肌组织呈小灶性坏死，少部分细胞结构模糊，边界不清(图 1C)；低、中、高剂量栀子苷组大鼠心肌可见坏死病灶，与缺血再灌注组比较，病灶相对较小，病灶区存在少数心肌纤维玻璃或波浪样改变，无明显的心肌纤维断裂、坏死等发生(图 1D、E、F)。

图 1

注：A：假手术组；B：缺血再灌注组；C：阳性对照组；D、E、F：栀子苷25、50、100 mg/kg组。 图 1 栀子苷对心肌缺血再灌注大鼠心肌组织病理学影响(HE，×200)

与假手术组比较，缺血再灌注组大鼠血清中LDH活力、心肌组织MDA水平明显升高，SOD活力、Ca²⁺-ATPase水平明显降低(P<0.05)；与缺血再灌注组比较，栀子苷50、100 mg/kg组大鼠血清LDH活性及心肌组织MDA水平明显降低，心肌组织中SOD活性和Ca²⁺-ATPase水平明显增加(P<0.05)；与缺血再灌注组比较，阳性对照组大鼠血清LDH活性及心肌组织MDA水平明显降低，心肌组织中SOD活性和Ca²⁺-ATPase水平明显增加(P<0.05)。

表 1

表 1 栀子苷对缺血再灌注大鼠氧化应激指标影响(x±s，n=10) 组别(mg/kg) LDH (U/L) SOD (NU/mgpro) MDA (nmol/mgpro) Ca2+-ATPase (mol/mg·h) 假手术组 4 217.8±649.6 45.59±2.46 1.08±0.15 0.89±0.16 缺血再灌注组 5 538.4±987.6b 30.54±4.29a 3.13±0.61b 0.31±0.09a 栀子苷 25 5 316.8±798.7 38.68±3.52 2.39±0.59 0.53±0.13 50 4 598.6±638.7c 41.48±3.86c 2.12±0.47c 0.71±0.11c 100 4 386.9±549.8d 43.47±3.88d 1.63±0.29c 0.72±0.13c 通心络胶囊100 4 371.8±538.5d 42.93±3.78d 1.45±0.22c 0.79±0.15c  注：与假手术组比较，a P<0.05，b P<0.01；与缺血再灌注组比较，c P<0.05，d P<0.01。

表 1 栀子苷对缺血再灌注大鼠氧化应激指标影响(x±s，n=10)

TUNEL染色显示，凋亡细胞呈棕色。假手术组、缺血再灌注组、栀子苷25、50、100 mg/kg组、阳性对照组大鼠心肌细胞凋亡率分别为(2.1±0.2)%、(21.2±2.6)%、(16.7±2.1)%、(12.3±1.8)%、(11.2±1.6)%、(10.3±1.4)%；与假手术组比较，缺血再灌注组大鼠心肌细胞凋亡率明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与缺血再灌注组比较，栀子苷50、100 mg/kg组、阳性对照组大鼠心肌细胞凋亡率明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

与缺血再灌注组比较，栀子苷50、100 mg/kg组大鼠心肌组织p53、Bax蛋白表达明显降低，Bcl-2蛋白及Bcl-2/Bax 比例明显增加(P<0.05)。与缺血再灌注组比较，阳性对照组大鼠心肌组织p53、Bax蛋白表达明显降低，Bcl-2蛋白及Bcl-2/Bax 比例明显增加(P<0.05)。

表 2

表 2 栀子苷对缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡 蛋白表达影响(x±s，n=10) 组别(mg/kg) p53 Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax 假手术组 1.01±0.18 1.25±0.21 0.65±0.25 1.92±0.23 缺血再灌注组 2.51±0.81 b 0.59±0.12 a 1.25±0.33 b 0.47±0.21b 栀子苷 25 1.83±0.47 0.66±0.12 0.97±0.28 0.68±0.19 50 1.71±0.35c 0.71±0.11c 0.95±0.24c 0.75±0.22c 100 1.62±0.59c 0.78±0.17c 0.89±0.19d 0.88±0.23c 通心络胶囊100 1.69±0.53c 0.72±0.15c 0.87±0.18d 0.83±0.26c  注：与假手术组比较，a P<0.05，b P<0.01；与缺血再灌注组比较，c P<0.05，d P<0.01。

表 2 栀子苷对缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡 蛋白表达影响(x±s，n=10)

心肌缺血容易导致心脏缺氧，严重时破坏细胞膜并造成细胞损伤^[3]，细胞膜的通透性明显增加，心肌细胞能量代谢障碍，细胞膜的泵功能下降，细胞膜上Ca²⁺-ATPase离子通道受到破坏，心肌细胞内的Ca^{2 +}不能及时泵出，产生钙超载，并引发细胞自我调节功能丧失，心肌细胞发生变性、坏死，LDH等酶漏出进入血清^[4]。因此测定血清中LDH及心肌组织Ca²⁺-ATPase等酶活性，可反应心肌损伤程度。心肌缺血再灌注时，容易导致大量代谢物聚集和自由基产生，过多的自由基通过脂质过氧化破坏细胞膜，导致细胞死亡^[5]。SOD具有清除超氧阴离子自由基功能，减少机体的氧化应激损伤，协调机体氧化与抗氧化平衡^[6]。因此，SOD活性可代表机体对自由基的清除能力。MDA 是细胞膜的不饱和脂肪酸过氧化产物，可反应氧自由基的活性，因此MDA 能体现机体发生脂质过氧化情况，并可间接反映细胞损伤程度^[7]。

本研究结果显示，中、高剂量栀子苷组大鼠血清LDH下降、Ca²⁺-ATPase活性升高，心肌组织SOD活性升高，心肌组织MDA含量降低；病理结果显示，发生缺血/再灌注损伤的大鼠心肌细胞明显肿胀，细胞核不规则，细胞界限不清晰，间隙增大，胞浆染色深浅不一，心肌纤维存在中性粒细胞浸润，而栀子苷处理后，心肌细胞坏死病灶明显减小，病灶区存在少数心肌纤维玻璃或波浪样变，无明显的心肌纤维断裂、坏死等发生，心肌损伤明显减轻。提示栀子苷预处理可保护心肌细胞，栀子苷抗心肌缺血再灌注损伤的机制与减少机体氧自由基生成，提高机体清除自由基的能力有相关。

研究表明氧化应激、缺血、缺氧、再灌损伤等与心肌细胞凋亡密切相关，而细胞凋亡发生的程度可反应心功能的破坏情况，而细胞凋亡的发生与信号通路介导的一系列程序密切相关^[8]。细胞凋亡与凋亡蛋白的有效调控相关，一般包括促凋亡和抗凋亡蛋白，而细胞凋亡的发生为二者之间平衡失调的结果^[8]。p53、Bcl-2 和Bax 蛋白为常见的凋亡蛋白，其中p53是诱导细胞调亡重要因素，当细胞发生DNA损伤或缺氧时，p53大量表达，并诱导凋亡蛋白Bax等表达，调节细胞周期和凋亡；Bcl-2具有抑制细胞凋亡功能，而Bax具有促进细胞凋亡功能，细胞凋亡是否发生由Bcl-2与Bax比例决定^[9]。Bcl-2 表达水平增加，Bcl-2/Bax异二聚体比例增加，抑制细胞凋亡；Bax蛋白水平增加时，Bcl-2/Bax比率下降，产生Bax /Bax同二聚体，细胞凋亡发生^[10]。本研究结果显示，中、高剂量栀子苷均能明显降低大鼠心肌细胞p53蛋白表达，上调Bcl-2/Bax比率，减少细胞凋亡的发生，并呈现剂量效应关系。提示，栀子苷可通过抑制p53表达，增加Bcl-2蛋白表达，降低Bax蛋白水平，从而抑制心肌细胞凋亡，起到保护心肌细胞作用。