基孔肯雅病毒(chikungunya virus,CHIKV)，最早是在1952年从坦桑尼亚发热病人分离出来^{[1, 2]}。在印度洋流域国家受其影响的人口多达300~400万，2005—2007年期间蔓延到欧洲大陆，中国也有CHIKV的自然疫源地。CHIKV感染的临床特征多为关节痛、高热、乏力、头痛、呕吐、皮疹和肌痛等症状^{[3, 4]}。由于该疾病的症状与登革热病毒感染类似，鉴别诊断比较困难^[5]。CHIKV属单股正链RNA病毒，其基因组包含2个开放阅读框架，1个合成非结构多聚蛋白，另1个合成衣壳、E3、E2、6K和E1结构蛋白，E2蛋白易成为中和抗体的靶体。目前已有较多使用疱疹性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)制备假病毒系统的研究报告(VSVΔG^*系统,其中，VSV-G被替换为GFP基因)^{[6, 7, 8, 9, 10, 11]}，这些VSV假病毒分别嵌入几种不同的RNA病毒的包膜糖蛋白(如麻疹病毒、汉坦病毒、埃博拉病毒或丙肝病毒^{[10, 12, 13]})。本研究通过构建具有基孔肯雅病毒包膜蛋白VSV假病毒，旨在为相关流行病学调查提供技术支持。

Eagle培养基(美国Sigma-Adrich公司)，Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)培养基、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、lipofectamine 2000试剂(美国Life/ Gibco公司)，10％热灭活小牛血清(美国Thermo Fisher Scientitic公司)，Western blot 试剂盒( 美国Pfizer公司)，辣根过氧化物酶horseradish peroxidase(HRP)标记的人抗鼠IgG( 美国Invitrogen公司)，萤光素酶测定试剂盒(美国Promega公司)，聚偏二氟乙烯膜(美国GE公司)，非洲绿猴肾上皮细胞(Vero)、BEAS-2B细胞，293T细胞(美国ATCC American Type Culture Collection)，MCO-18AC型二氧化碳培养箱(日本SANYO公司)，DMIL-PH1荧光倒置相差显微镜(德国LEICA公司)。

细胞在5％CO₂ 37 ℃条件下孵育，Vero细胞使用Eagle培养基培养，BEAS-2B细胞在1640培养基中培养，293T细胞在DMEM培养基培养，培养基中加入10％热灭活小牛血清和100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素。

CHIKV菌株号为37997(GenBank登录号为no.EU224270)基因组，编码结构多蛋白E3-E2-6k-E1的DNA序列按照哺乳动物细胞常用蛋白表达的密码子优化合成(日本大阪大学微生物病研究所Takeda教授)。使用含有1个起始密码子和1个SanI位点(5′-AAAGAGCTCATGAGTCTGGCCCTGCCAGT-3′)的上游引物和含有1个终止密码子和NheI位点(5′-TTTGCTAGCTCAATGCCTGGAAAATGA-3′)的反义引物进行PCR扩增，将PCR产物插入到pCAGGS.MCSII真核表达载体，构建pCAGGS-CHIKV E2E1^[9]。使用空载体pCAGGS 作为阴性对照,根据制造商操作手册，使用lipofectamine2000试剂表达转染293T细胞，制备的假病毒感染BEAS-2B细胞后，在荧光显微镜下观察表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)细胞图像。

将沉淀的病毒粒子溶解在十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)样品缓冲液中(每孔100 μL)，加20 μL 样品到12％的凝胶中电泳，转染到聚偏二氟乙烯膜上，被CHIKV E2单克隆抗体(法国巴斯德研究所德普雷教授惠赠)免疫标记的病毒蛋白室温放置1 h^[14]，加入HRP标记人抗鼠IgG，用Western blot试剂盒检测膜上特异性反应。

在293T细胞转染pCAGGS-CHIKV E2E1 36 h后，将293T细胞用VSVΔG^*-G在37 ℃感染1 h，293T细胞单层用含1％热灭活胎牛血清磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，加入培养液，在CO₂培养箱37 ℃ 孵育24 h。通过低速离心将培养物上清液澄清，用25％蔗糖部分纯化后保存在 -80 ℃中(VSVΔG^*-G由美国圣犹达儿童研究医院Whitt教授、日本大阪大学微生物病研究所Matsuura教授惠赠)^{[10, 15]}。

使用萤光素酶测定试剂盒测定感染细胞萤光素酶活性。取培养液30 μL(含有300 international unit(IU)VSV-E2E1假病毒)与等倍系列稀释CHIKV E2单克隆抗体混合37 ℃ 孵育1 h，取50 μL混合物接种到96孔培养板Vero E6细胞单层中；吸附1 h后，phosphate buffered saline(PBS)洗3次，加入培养基，培养16 h，收集细胞进行萤光素酶活性测定,计算各稀释度感染百分比(未加入E2抗体的酶活性定义为100%)。

在荧光显微镜下，使用空载体pCAGGS 转染制备的假病毒感染BEAS-2B细胞无GFP表达(图 1A)，而用CHIKVE2E1 转染293T制备的假病毒感染BEAS-2B 后存在GFP的表达(图 1B)。VSV-E2E1假病毒颗粒经过Western blot免疫印迹确证，CHIKVE2E1在50 kDa 处出现明显的条带(图 2)。

图 1

图 1 转染CHIKV E2E1的细胞图象

图 2

图 2 VSV-E2E1假病毒Western blot免疫印迹分析

结果显示，VSV-E2E1假病毒在CHIKV E2单克隆抗体1：2 000稀释度时酶活性为2.73%，1:4 000稀释度时酶活性为9.61%，1:8 000稀释度时酶活性为19.76%，1:16 000稀释度时酶活性为29.23%，1:32 000稀释度时酶活性为41.68%，1:64 000稀释度时酶活性为74.84%；无病毒感染的阴性对照酶活性为2.46%。在1：2 000稀释度荧光素酶活性的降低与无感染组(阴性对照)达到了相近水平，是抑制病毒感染的最低稀释度。

据报道，2005—2006年在留尼旺岛有三分之一人口感染了CHIKV^[16]，中国广州及云南也发现了CHIKV感染者。CHIKV感染严重威胁着免疫力低下人群，可引起慢性关节痛，但目前对其发病机制知之甚少。开展对CHIKV感染病人的详细研究，将有助于揭示免疫反应在疾病发展中的作用。

本研究使用萤光素酶或GFP检出VSV-E2E1假病毒，成功建立一套安全方便的CHIKV检测系统。该系统能够在不接触野生CHIKV情况下调查CHIKV宿主，检测工作在生物安全2级实验室即可进行。此外，可通过简单的荧光测定法测定假病毒基因组表达的GFP或测量萤光素酶活性，推测假VSV-E2E1的感染性。本研究使用的VSV载体比慢病毒载体具有优势，因为制备假慢病毒载体需要采用磷酸钙介导的方法，技术上既困难又繁琐^{[8, 17]}。利用假病毒介导的方式能适合多个感染环节检测，包括受体和膜融合研究，这可能与假VSV-E2E1的CHIKV蛋白质包膜的天然功能有关。本检测系统简便易行，且假VSV-E2E1病毒感染可与E2抗体有效中和，可应用于疫区CHIKV抗体的筛查工作。