大脑认知功能的增龄性衰退表现为学习记忆功能降低，是评价机体衰老的重要指标之一。药理学研究表明：枸杞子富含枸杞多糖、黄酮类物质、多种维生素和微量元素，具有抗衰老,抗肿瘤^[1]作用。海马结构是参与哺乳动物学习记忆功能的关键脑区，有丰富的胆碱能纤维及其受体。本研究采用Morris 水迷宫评价小鼠学习记忆功能，ELISA法检测小鼠海马结构内毒蕈碱型乙酰胆碱受体M1 亚型(muscarinic acetylcholine receptor M1,M1R)的含量，旨在研究枸杞子提取物对自然衰老小鼠学习记忆功能的改善作用，探究其对海马结构内M1R的影响，进一步揭示枸杞子抗衰老作用机制。

健康雄性清洁级昆明种小鼠75只(购自辽宁长生生物技术有限公司，生产许可证号：SCXK(辽)2010-0001，使用许可证号：SYXK(辽)2010-0006)，自由摄食、饮水。15只2月龄小鼠为成年对照组，体重28~33 g。60只12月龄小鼠为老年组，体重46~52 g，随机将其分为4组：老年对照组、枸杞子水提取物高、中、低(相当于生药量100、50、25 mg/mL)剂量组，每组15只。各给药组按照各自浓度灌胃给药0.1 mL/10 g，成年及老年对照组予等量蒸馏水。每天1次，连续17周。

取干燥枸杞子10 g，冷冻粉碎，加入40 ℃蒸馏水100 mL浸泡1 h，煎煮40 min，过滤，收集滤液，即为10%枸杞子全汁，其浓度相当于生药量100 mg/mL。将其进一步按1∶1，1∶3蒸馏水稀释，即为5%及2.5%中、低浓度枸杞子全汁，相当于生药量50 mg/mL，25 mg/mL。

宁夏产优质枸杞子(国大天益堂药房)，小鼠乙酰胆碱受体M1 ELISA 试剂盒(美国 Bluegene 公司)。Morris 水迷宫(成都泰盟科技有限公司)；Biofuge 28RS低温高速离心机(德国Heraeus Sepatech公司)；ELx800酶标仪(美国BioTek公司)；Heros-Mole TL2020 高通量组织研磨仪(北京鼎号源科技有限公司)。

(1)定位航行实验(反应空间记忆的获得能力)：于实验第17周起，在继续给药的条件下，对75只小鼠进行水迷宫训练5 d，每天训练2次，每次60 s。将小鼠面朝池壁放入水中，同时启动记录装置，通过该系统的图像分析软件可获得小鼠在水中的逃避潜伏期。小鼠找到并爬上平台后，让其停留5 s，若小鼠入水后60 s 内未能找到并爬上平台，则将其引导至平台上停留10 s，此时逃避潜伏期记录为60 s。每次训练完成后,迅速将小鼠擦干,防止低体温。每天各小鼠逃避潜伏期用2次训练的均值表示。(2)空间搜索实验(检测空间记忆的保持能力)：水迷宫实验的第6 d 撤去平台，每只小鼠从固定象限中点面朝池壁放入水中，记录小鼠60 s池内活动情况，通过该系统的图像分析软件获得60 s内小鼠经过原平台所在靶象限的时间。将不符合实验要求的小鼠去除，保证每组10只动物。

完成空间搜索实验后立即断头处死小鼠，冰上分离双侧海马，置于-80 ℃保存，以备检测各组海马结构M1受体水平。

先用预冷的磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS,0.02 mol/L,pH 7.0~7.2)清洗组织后称质量，5 mg组织加入40 μL预冷PBS(0.02 mol/L,pH 7.0~7.2)。用高通量组织研磨仪裂解细胞，5000 r/min离心15 min后取上清。按照ELISA试剂盒说明书操作，分别将标准品及样品各100 μL加入微孔中，空白对照加入100 μL PBS(pH 7.0~7.2)。取10 μL平衡液加入100 μL样品中。在各孔中加入50 μL的酶标记溶液(不含空白对照组)。37 ℃ 孵育反应1 h。充分清洗酶标板5次，酶标板洗涤后用吸水纸彻底拍干。各孔加入显色剂A、B各 50 μL。37 ℃避光反应15 min。终止反应后使用酶标仪(490 nm波长)依序测定各样品中M1受体的含量。

所有数据均用x±s表示，采用SPSS 17.0软件进行统计分析，t检验进行统计学处理。P<0.05为差异有统计学意义。

高、中、低给药组小鼠皮毛光滑，身体健壮，活动正常，对外界刺激反应灵敏；老年对照组小鼠皮毛暗淡，对外界刺激反应迟钝；成年对照组小鼠皮毛顺滑，对外界刺激反应机警。

小鼠经过5 d的Morris水迷宫定位航行实验，各组第5 d逃避潜伏期均值均较本组第1 d明显缩短，差异有统计学意义(P<0.01)。表明随着定位航行训练次数的增加，各组小鼠都具有了一定的空间学习能力。老年对照组第5 d逃避潜伏期较成年对照组明显延长(P<0.01)。不同浓度的枸杞溶液灌胃给药后，第5 d逃避潜伏期较老年对照组明显缩短(P<0.05)。

表 1

表 1 枸杞溶液对小鼠学习能力的影响(x±s) 组别 n 第1天逃避 潜伏期(s) 第5天逃避 潜伏期(s) 成年对照组 10 52.87±8.23 31.26±9.13a 老年对照组 10 58.20±3.18 44.81±7.84ab 老年组予枸杞汁(mg/mL) 100 10 55.73±10.35 37.51±9.47ac 50 10 54.37±11.63 38.13±11.81ac 25 10 56.69±7.86 41.07±8.85ad  注：与各自第1d潜伏期比较，a P<0.01；与成年对照组比较，b P<0.01；与老年对照组比较，c P<0.01,d P<0.05。

表 1 枸杞溶液对小鼠学习能力的影响(x±s)

小鼠完成5 d的Morris水迷宫定位航行实验后，于第6 d进行空间探索测试，各组小鼠在原平台所在靶象限活动情况。老年对照组在平台所在象限的停留时间及过平台次数明显低于成年对照组(P<0.01)。各枸杞给药组上述指标较老年对照组明显改善(P<0.05)。

表 2

表 2 枸杞溶液对小鼠记忆能力的影响(x±s) 组别 n 平台象限停留时 间百分比(%) 过平台 次数(次) 成年对照组 10 42.17±8.21 5.27±0.61 老年对照 10 28.82±3.18a 2.13±0.32a 组老年组予枸杞汁(mg/mL) 100 10 38.75±5.35b 3.89±0.47b 50 10 36.34±7.62b 3.51±0.28b 25 10 31.65±6.19c 3.09±0.63c  注：与成年对照组比较，a P<0.01；与老年对照组比较，b P<0.01；与老年对照组比较，c P<0.05。

表 2 枸杞溶液对小鼠记忆能力的影响(x±s)

小鼠经过17 周的枸杞灌胃给药及为期6 d的水迷宫实验测试后，取海马并采用ELISA法检测各组海马M1受体浓度的差异。老年对照组海马M1受体浓度明显低于成年对照组(P<0.01)。各枸杞给药组该指标较老年对照组明显提高(P<0.01)。

表 3

表 3 枸杞溶液对小鼠海马M1受体的影响(x±s) 组别 n 海马M1受体浓度(pg/mL) 成年对照组 10 1 563.29±312.15 老年对照组 10 976.42±321.37a 老年组予枸杞汁(mg/mL) 100 10 1 325.81±327.76b 50 10 1 219.35±307.49b 25 10 1 137.84±339.63b  注：与成年对照组比较，a P<0.01；与老年对照组比较，b P<0.01。

表 3 枸杞溶液对小鼠海马M1受体的影响(x±s)

本研究表明，老年对照组小鼠的学习记忆能力较健康成年小鼠明显降低，而枸杞子提取物高、中、低剂量组可改善之。枸杞子水溶性提取物的抗氧化活性高于脂溶性提取物^[3]，且无不良副作用^[4]。枸杞提取物能改善老年痴呆早期轻度的认知障碍^{[5, 6]}。海马结构与认知功能^{[7, 8]}、位置导航^[9]有关，可对不同感觉信息总和起来的空间模式进行编码^[10]。海马组织与大脑皮层及皮层下中枢形成广泛的纤维连接，特别是胆碱能神经纤维连接，通过这些神经纤维连接构成的信息通路将短时记忆转为长时记忆，并在空间航行定位功能中起重要的作用^[11]。海马组织中富含乙酰胆碱等神经递质^[12]，参与学习记忆过程。

M1R是参与兴奋性海马环路的胆碱能纤维直接调节的主要M受体亚型^[13],主要分布于大脑皮质、海马结构、纹状体等神经组织，海马结构内的M1R直接参与空间学习记忆过程^[14]。M1R有利于哺乳动物对线索的探查行为，也是乙酰胆碱对锥体细胞兴奋性发挥最直接作用的充要条件^[15]。大鼠海马神经元细胞表面M1R激活可引发磷脂酰肌醇水解以及θ节律的网络振荡，瞬时提高长时程增强(long-term potentiation,LTP)，而细胞内的M1R激活可使细胞外的调节激酶磷酸化，逐渐提高LTP^[16]。本研究结果发现，老年对照组小鼠M1R含量明显低于成年对照组，而枸杞高、中、低3个剂量组海马结构M1R的浓度较老年对照组小鼠明显升高，提示枸杞改善小鼠学习记忆功能可能与其海马结构内M1R的浓度增高有关。