麦角甾醇(ergosterol)是一种重要的植物甾醇，是甾类化合物之一^[1]。从香菇、巴西菇等食用真菌中可提取分离出麦角甾醇，且分离效率高、产品纯度高。研究表明麦角甾醇可增强人体抵抗疾病的能力，具有明显的抑菌、抗肿瘤功效^[2]，同时，麦角甾醇还是重要的脂溶性维生素D2源。本研究以S180荷瘤小鼠为动物模型，通过观察抑瘤率变化、肝脏抗氧化能力指标及肿瘤组织中survivin蛋白表达变化，探讨麦角甾醇抗肿瘤作用及机制，结果报告如下。

麦角甾醇(湖北省农业科学院惠赠)由香菇中提取，纯度约90%^[3]；S180小鼠腹水瘤细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)；注射用环磷酰胺(cytoxan,CTX)(江苏恒瑞医药公司)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathion peroxidase，GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；RPMI-1640、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(美国Gibco公司)；抗survivin抗体( 美国CST公司)；抗β-actin抗体(天津三箭公司)；电泳仪(北京六一仪器厂)；倒置显微镜(日本Olympus公司)；紫外分光光度计(日本岛津公司)。

4~6周龄SPF级昆明种小鼠(湖北省实验动物研究中心)，许可证号：SYXK(鄂)2008-0014，共60只，18~22 g，雌雄各半，饲养环境为温度18~22 ℃，湿度50%~60%，饲喂普通小鼠饲料。

(1)腹水瘤细胞接种：用无菌生理盐水稀释对数生长期细胞，将密度调整为2~3×10⁶个/mL，制成细胞悬液。随机选取小鼠10只，每只腹腔注射0.4 mL腹水瘤细胞悬液。约1周后，小鼠腹部明显涨大、凸起，将小鼠颈椎脱臼处死，于超净台内无菌抽取乳白色腹水液，用生理盐水稀释，调整细胞数为1~2×10⁷个/mL备用。(2)动物模型建立：50只小鼠(雌雄各半)于右上肢腋部皮下处接种腹水瘤细胞悬液0.2 mL。接种前，瘤细胞悬液均用0.4%台盼蓝染色，活细胞数＞90%。从抽取腹水开始，至最后1只小鼠接种完毕，总时间控制在1 h以内。接种24 h后，将小鼠随机分为5组，每组10只，雌雄各半。分别为模型组：蒸馏水100 mL/kg灌胃+生理盐水100 mL/kg腹腔注射，环磷酰胺组：蒸馏水100 mL/kg灌胃+环磷酰胺20 mg/kg腹腔注射，高、中、低剂量麦角甾醇组：麦角甾醇(分别灌胃给予400、300、200 mg/kg麦角甾醇+生理盐水100 mL/kg腹腔注射。连续21 d，每天观察肿瘤的形成及生长情况。

末次给药后禁食24 h，颈椎脱臼法处死小鼠，完整剥离瘤块并称重，部分组织固定于10%中性甲醛或冷藏于-80 ℃冰箱中，备用。抑瘤率(%)=(对照组平均瘤重-麦角甾醇或环磷酰胺组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%。

肿瘤组织部分固定于10%中性甲醛中后，按照苏木素-伊红染色法^[5](hematoxylin-eosin staining，HE)操作步骤进行，普通光学显微镜下观察肿瘤组织弥散程度，坏死情况，坏死区及瘤细胞浸润程度等指标。

取各组小鼠肝脏组织约50 mg，使用玻璃匀浆器匀浆，将制备好的10%匀浆液2 500 r/min离心10 min，取上清液，按照SOD、GSH-Px、MDA测定试剂盒说明书进行操作，测定肝脏中SOD、GSH-Px活力和MDA浓度。

采用Western blot法，取各组小鼠肿瘤组织约50 mg，加入总蛋白提取液，匀浆，将匀浆液9 000 r/min离心10 min，取适量上清液测定总蛋白含量。提取出的总蛋白用15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,而后将蛋白转印至聚偏二氟乙烯膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液于4 ℃封闭4 h，4 ℃一抗(兔抗人survivin多克隆抗体,稀释比例均为1:800)孵育过夜；洗膜后,室温二抗孵育1 h(山羊抗兔IgG,稀释比例均为1:10 000)；辣根过氧化物酶化学发光试剂显色。阳性条带以Quantity One 4.62 版凝胶光密度分析软件分析，以累积光密度参考值(IOD)表示survivin蛋白相对表达量。

计量资料以x±s表示，采用SPSS 17.0软件进行数据处理和统计分析，计量资料比较采用t检验，计数资料比较采用χ²检验，P<0.05为差异有统计学意义。

接种瘤细胞8 d后，可明显观察和触及到小鼠腋窝肿块，成瘤率为100%。与模型组比较，高、中、低剂量麦角甾醇组小鼠肿瘤重量明显减轻，差异有统计学意义(P<0.05)；与麦角甾醇组比较，环磷酰胺组小鼠肿瘤重量明显减轻，差异有统计学意义(P<0.05)。提示，各剂量麦角甾醇对小鼠均有抑瘤作用，且在一定范围内，呈现剂量效应关系，但抑瘤作用不如环磷酰胺明显。

表 1

表 1 麦角甾醇对各组小鼠抑瘤作用(x±s，n=10) 组别(mg/kg) 瘤重(g) 抑瘤率(%) 模型组 3.35±0.20 — 环磷酰胺组 20 1.54±0.19 53.96 麦角甾醇组 400 1.95±0.21ab 41.64 300 2.34±0.22ab 29.90 200 2.69±0.19ab 19.52  注：与模型组比较，a P<0.05；与环磷酰胺组比较，b P<0.05。

表 1 麦角甾醇对各组小鼠抑瘤作用(x±s，n=10)

模型组小鼠肿瘤细胞排列紧密，组织内间质少，少见凋亡形态学改变，少见核固缩，新生血管丰富(图 1A)；高剂量麦角甾醇组小鼠肿瘤周围细胞纤维受到破坏，且伴随肿瘤组织内微血管减少，部分细胞出现核固缩(图 1B)；中剂量麦角甾醇组小鼠肿瘤组织中多核巨瘤细胞明显减少，间质增多，分布弥散(图 1C)；低剂量组细胞体积明显缩小，周围有炎症细胞浸润(图 1D)。

图 1

注：A:模型组；B、C、D：高、中、低剂量麦角甾醇组。 图 1 麦角甾醇对小鼠肿瘤组织病理学影响(HE，×400)

与模型组比较，环磷酰胺组、高、中剂量麦角甾醇组小鼠肝脏中SOD、GSH-Px活力明显升高、MDA水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。提示，高、中剂量麦角甾醇可明显提高小鼠肝脏抗氧化能力。

表 2

表 2 麦角甾醇对小鼠肝脏组织抗氧 化能力影响(x±s，n=10) 组别(mg/kg) SOD (U/mg prot) MDA (nmol/mg prot) GSH-Px (U/mg prot) 模型组 49.86±16.64 39.48±6.17 5 322.83±473.47 环磷酰胺组 20 38.60±11.89a 49.77±7.46a 4 678.31±776.660a 麦角甾醇组 400 69.19±12.18ab 24.59±6.87ab 6 982.69±1141.96ab 300 66.30±8.80ab 31.43±7.05ab 6 414.43±932.96ab 200 51.36±12.30b 36.47±13.50ab 5 984.48±1502.38  注：与模型组比较，a P<0.05；与环磷酰胺组比较，b P<0.05。

表 2 麦角甾醇对小鼠肝脏组织抗氧 化能力影响(x±s，n=10)

模型组、环磷酰胺组、高、中、低剂量麦角甾醇组小鼠肿瘤组织中survivin蛋白表达量分别为(0.85±0.09)、(0.58±0.05)、(0.40±0.05)、(0.66±0.07)、(0.86±0.07)。与模型组比较，高、中剂量麦角甾醇组小鼠肿瘤组织中survivin蛋白表达水平明显下调(P<0.05)。

图 2

注：1：模型对照组；2：CTX组；3~5：高、中、低剂量麦角甾醇组。 图 2 麦角甾醇对肿瘤组织survivin蛋白表达影响

Yasukawa等^[6]从真姬菇子实体中分离出麦角甾醇并发现其对小鼠皮肤癌有显著抑制作用。高虹等^[7]通过实验证明麦角甾醇抗肿瘤活性很有可能是通过抑制血管生长实现的。本研究结果表明，麦角甾醇可使苛瘤小鼠肿瘤组织体积和质量减小，使肿瘤组织病理结构发生变化，出现肿瘤细胞核固缩、微血管减少等变化。提示麦角甾醇对S180荷瘤小鼠肿瘤具有一定程度抑制作用。

研究证实，正常情况下自由基生成与清除之间的动态平衡是以SOD、GSH-Px为主的酶系统和非酶类抗氧化防御系统来维持^[8]。当自由基的产生与消除失衡时，过多的自由基可直接损伤DNA，也可通过脂质过氧化作用间接损伤DNA，最终引起癌变^[9]。本研究结果显示，与模型组比较，麦角甾醇组小鼠肝脏中SOD、GSH-Px活力升高、MDA含量下降。提示，麦角甾醇可提高小鼠抗氧化酶活力，提高清除自由基和抗氧化的能力，从而降低脂质过氧化程度，最终达到抑制肿瘤效果。

研究表明survivin作为近年来被发现的凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族中的新成员，其细胞凋亡抑制效应最强，组织学表达具备肿瘤高度特异性，在抑制肿瘤细胞凋亡方面发挥重要作用，可抑制肿瘤细胞凋亡，并促进细胞增殖，参与细胞周期的调控，参与并促进血管形成^[10]。本研究结果表明，与模型组比较，高、中剂量麦角甾醇组小鼠肿瘤组织中survivin蛋白表达明显下调。提示，麦角甾醇抑制肿瘤细胞的主要机制可能与增加肝脏抗氧化能力、下调肿瘤组织中survivin蛋白表达有关。