流感是一种急性呼吸道传染病，虽然流感病毒通常是自限性的，但在婴儿、老人、和患有慢性疾病的人群中有着较高的死亡率，每年因流感病毒感染而死亡的人数高达100万^[1]。迄今为止，最有效的预防流感病毒感染的方法是接种流感病毒疫苗，但作为获得性免疫，起效慢、作用专一，人们有时会在疫苗提供有效保护前已经发生了病毒感染^[2],因此迫切需要起效快、作用范围广、可增强疫苗免疫原性的新物质来预防和控制流感的发生与流行。未甲基化CpG 的寡核苷酸片段(CpG oligonucleotides，CpG ODN)是人工合成的以非甲基化的胞嘧啶(C)-鸟嘌呤(G)为核心的寡核苷酸链，已被确定为Toll样受体9(Toll like receptor 9，TLR9)的特异性配体，能快速激活多种免疫细胞，可作为有效、广谱的抗病毒策略来对抗病毒感染^[3]。近几年CpG在抗病毒感染中的作用已受到研究者的广泛关 注^{[4, 5]}。本研究以(人喉癌上皮细胞)(Hep 2)为模型，通过观察CpG ODN体外抑制流感病毒复制作用，探索其对流感的治疗学价值。

季节性流感病毒A[辽宁西岗/1136/2009(H1)株](大连市疾病预防中心微生物实验室保存)，通过红细胞凝集抑制试验及荧光定量PCR确认病毒亚型，空斑形成试验确定病毒滴度,用感染复数(multiplicity of infection，MOI)表示结果；CpG ODN：GTCGTTGTCGTTGTCGTT(大连宝生物公司合成)，达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbeccos modifiedeagle medium，DMEM)(美国Gibco公司)，胎牛血清(美国HyClone公司)，RNA提取试剂盒(美国Promega公司)，PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser逆转录试剂和SYBR Premix Ex Taq^TM Ⅱ试剂(大连宝生物有限公司)，管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase，GAPDH)、TLR9、白细胞介素-6(interleukin 6，IL 6)、干扰素-β(interferon β，IFN β)和肿瘤坏死因子-α(tumour necrosis factor α，TNF α)及流感病毒基因(Inf A)的real time PCR 引物由上海生工生物工程公司合成(表 1)。

表 1 (Table 1)

表 1 PCR引物序列 目的基因 引物序列(5'-3') 产物长度(bp) 登录号. GAPDH F GTGGACCTGACCTGCCGTCT 153 M33197 R GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT TLR9 F AATTCCCATCTCTCCCTGCT 135 NM_017442 R TCCTTCACCCCTTCCTCTTT IL-6 F TGTGAAAGCAGCAAAGAGGCACTG 194 NM_000600 R ACAGCTCTGGCTTGTTCCTCACTA IFN-β F CATTACCTGAAGGCCAAGGA 150 M28622 R AGCAATTGTCCAGTCCCAGA TNF-α F GCCCCAATCCCTTTATTACC 145 M10988 R CACATTCCTGAATCCCAGGT Inf-A F GACCRATCCTGTCACCTCTGAC 106 GQ221697 R AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA

表 1 PCR引物序列

将Hep 2细胞接种于含10%灭活胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 mg/mL链霉素的DMEM完全培养液中，置37 ℃，5%CO₂培养箱中培养，2 d换液1次； 细胞传代时，弃培养液，磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)洗2次，加入适量0.5%胰蛋白酶消化，制备单细胞悬液，分装到细胞培养瓶中，加入适量培养液继续培养。

调细胞密度为1×10⁵个/孔，接种于24孔板中，37 ℃，5%CO₂条件下过夜、弃去培养液，用PBS洗2次，吸弃残余PBS，加入甲型季节性H1N1流感病毒(seasonal influenza A H1N1，sH1N1)悬液100 μL(MOI=0.01)，孵育1 h，弃去病毒液，加含1.5 μg/mL胰酶的无血清培养基1 mL，于37 ℃，5%CO₂条件下继续培养，分别于1、8、24、48、72、96 h弃去培养液，加入细胞裂解液300 μL，用移液器吹打数次后，收集裂解液，-80 ℃保存备用。

同上述将Hep 2细胞接种于24孔板中，除对照孔外，其余各孔加入终浓度5 μmol/L CpG ODN培养液1 mL，于37 ℃，5%CO₂条件下培养1、8、24、48、72、96 h时，弃去培养液，加入细胞裂解液300 μL，用移液器吹打数次后，收集裂解液，-80 ℃保存备用。

同上述将Hep 2细胞接种于24孔板中，量效实验设6组：对照组、病毒组、CpG ODN 1、2.5、5、10 μmol/L组(不同浓度CpG ODN预处理Hep 2细胞 24 h)；时效实验设6组：对照组、病毒组、预处理6、12、24、48 h组(最佳浓度CpG ODN预处理Hep 2细胞不同时间)；每组均设3个平行孔。于37 ℃，5%CO₂条件下孵育相应时间后弃培养液，用PBS洗2次，除对照外，其余各组加入sH1N1悬液100 μL，孵育1 h，弃去病毒液，加含1.5 μg/mL胰酶的无血清培养基1 mL，于37 ℃，5%CO₂条件下继续培养48 h，弃去培养液，加入细胞裂解液300 μL，用移液器吹打数次后，收集裂解液，-80 ℃保存备用。

将所得细胞裂解液，按Maxwell 16核酸自动纯化仪(美国Promega公司)说明书提取样品总RNA，逆转录，在ABI 7500定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)上进行SYBR Green实时定量PCR；以GAPDH为内参，计算各因子mRNA相对表达量。sH1N1 病毒拷贝数计算：将含有流感病毒基因的重组质粒10倍系列稀释(1×10¹~1×10⁶ copies)作为标准模板，采用荧光定量PCR方法，通过CT值与病毒拷贝数的对数绘制标准曲线，建立直线回归方程，计算各样品病毒拷贝数^[6]。

数据以x ±ｓ表示，采用Origin 7.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

结果表明，细胞感染病毒后8 h开始观察到病毒载量上升,为8.81×10⁴ copies/mL；48 h达到峰值，为8.06×10⁷ copies/mL； 72 h开始下降，96 h时下降至1.19×10⁷ copies/mL。病毒感染Hep 2细胞时不加胰蛋白酶，在任何时间点均不能检测到病毒复制。

结果显示，经CpG ODN诱导的Hep 2细胞TLR9和细胞因子 mRNA的表达量均有所增高，呈时间依赖性(P＜0.05)；TLR9及细胞因子IL 6、IFN β和TNF α的mRNA表达高峰均出现在作用72 h时。

表 2 (Table 2)

表 2 CpG ODN对Hep 2细胞中TLR9及细胞因子 mRNA表达影响(x ±ｓ，n=3) 组别(h) TLR9 IL-6 IFN-β TNF-α 对照组 1.0 1.0 1.0 1.0 作用 1 1.03±0.4 5.70±2.4a 1.30±0.4 2.80±0.8a 8 1.78±0.8a 1.08±0.7 1.17±0.3 2.58±0.8a 24 2.50±0.5a 0.96±0.5 0.86±0.6 3.60±1.5a 48 5.30±1.4a 28.20±3.2a 3.20±1.06a 3.80±1.3a 72 18.60±3.6a 96.20±21.4a 33.70±5.4a 17.20±3.4a 96 9.40±2.2a 19.60±5.6a 9.50±3.6a 2.40±1.6a  注：与对照组比较，a P<0.05。

表 2 CpG ODN对Hep 2细胞中TLR9及细胞因子 mRNA表达影响(x ±ｓ，n=3)

结果显示，病毒组Hep 2 细胞内病毒载量为8.36×10⁷ copies/mL，CpG ODN 1、2.5、5、10 μmol/L组的Hep 2 细胞内 sH1N1病毒载量分别为(5.29×10⁷)、(1.25×10⁷)、(3.43×10⁶)、(4.63×10⁶)copies/mL；与病毒组比较，各浓度CpG ODN组 Hep 2 细胞内病毒拷贝数明显降低(P<0.05)，呈剂量效应关系；其中CpG ODN 5 μmol/L组的Hep 2 细胞内病毒载量低于其余各CpG ODN组，提示5 μmol/L的CpG ODN预处理Hep 2细胞其抗sH1N1效果最佳。

病毒组Hep 2 细胞内病毒载量为(8.87×10⁷)copies/mL，CpG ODN(5 μmol/L) 预处理6、12、24、48 h时，Hep 2细胞内sH1N1病毒载量分别为(8.29×10⁷)、(4.55×10⁷)、(3.43×10⁶)、(3.67×10⁶)copies/mL；随着CpG ODN预处理时间延长，病毒拷贝数呈逐渐降低趋势，呈时间效应关系(P<0.05)。CpG ODN预处理24 h时，Hep 2 细胞内病毒拷贝数最低(P<0.05)，提示CpG ODN预处理Hep 2细胞24 h其抗sH1N1效果最佳。 3 讨 论

有研究表明，喉上皮细胞可表达多种TLRs，是产生细胞因子的主要场所，可启动机体天然免疫继而促进获得性免疫^[7]。Hep 2细胞为人喉癌上皮细胞系，以Hep 2细胞为模型，分析细胞抗病毒反应是一条有效的抗流感类药物发现的途径。Li等^[6]研究表明，病毒载量≥10⁶ copies/mL的sH1N1流感病毒只在消化道、肝、肾和肌肉、人下呼吸道的细胞株中检测到。本研究结果显示，Hep 2细胞在感染sH1N1后，病毒载量明显升高，于感染后48 h达到峰值，为(8.06×10⁷)copies/mL，表明Hep 2细胞对流感病毒敏感，sH1N1有能力在上呼吸道细胞中复制；但72 h 时，病毒载量反而逐渐减少，可能与随着病毒感染时间延长，受感染的贴壁Hep 2细胞开始脱落、死亡，导致收集的细胞明显减少，从而使测得的病毒载量减少有关。

微生物成分被TLR识别后，可激活一系列的信号转导通路，最终产生细胞因子、干扰素等效应物发挥抗病毒作用^{[8, 9]}。干扰素能够抑制病毒复制，并诱导一系列细胞内蛋白表达，发挥抗病毒效应和调节免疫应答^[10]。IL 6可通过促炎症反应活性和影响其他细胞因子产生来增加机体的抵抗力^[11]。TNF具有多种生物效应，主要是介导抗肿瘤及调节机体的免疫功能，且有广泛的抗病毒活性，TNF α在体外对呼吸道病毒具有明显的抗感染作用^[12]。本研究结果表明CpG ODN可活化Hep 2细胞的Toll样受体9，诱导细胞IFN β、IL 6和TNF α表达。提示，CpG ODN可能通过活化Hep 2细胞释放免疫活性物质(如IFN β、IL 6和TNF α等)而抑制sH1N1病毒的复制。

人工合成特定的CpG ODN在体内外具有广泛且强烈的免疫刺激活性，能促进多种免疫细胞活化，具有安全、有效等优点，但也存在许多问题，如免疫激活机制、免疫剂量和最适免疫时间等^[13]。本研究结果显示，不同浓度CpG ODN作用细胞24 h，均能明显下调细胞病毒载量水平，且呈剂量依赖性，CpG ODN浓度为5 μmol/L时抑制效果最明显，提示只有适当剂量的CpG ODN才能更好的激活细胞免疫反应，发挥抑制病毒复制作用；用同一浓度CpG ODN作用Hep 2细胞不同时间，均能下调病毒载量水平，且呈时间依赖性。提示CpG ODN刺激免疫细胞释放免疫活性物质，只有经过适当的时间积累到一定剂量以后，才能有效抑制病毒的复制。