双氢青蒿素(dihydroartemisinin，DHA)是青蒿素在体内主要的活性代谢产物，目前已作为抗疟疾药物在临床上应用。DHA的口服生物利用度高于青蒿素10倍以上，其抗疟疾作用是青蒿素的4~8倍。另外，双氢青蒿素还具有高效低毒、价格低、易天然提取等优点^[1]。研究发现，DHA对肿瘤细胞具有选择性杀伤和逆转肿瘤细胞耐药性等优点^{[2, 3, 4]}。因此，DHA有望成为抗肿瘤药物而应用于临床。本研究通过观察DHA对胶质瘤细胞生长的抑制作用，并探讨其可能机制，旨在为双氢青蒿素在临床上作为抗肿瘤药物应用提供依据。结果报告如下。

大鼠脑胶质瘤C6细胞株(吉林医药学院科研实验中心)；DHA(成都欧康植化科技有限公司)，溶于二甲基亚枫(dimethyl sulfoxide,DMSO)配成50 mmol/L浓度备用；1640培养液(美国Hyclone公司)；0.25%胰酶和小牛血清(美国Gibco公司)；DMSO和四甲基偶氮唑[3 (4,5 dimethylthiazol 2 yl) 2,5 phenyltetrazolium bromide,MTT](美国Sigma公司)；Bcl 2、Bax和caspase 3抗体 (北京中杉公司)；β actin抗体(美国Santa Cruz公司)。J 26XP型超低温高速离心机(美国贝克曼公司)；PLUS 384型全自动酶标仪(美国MDC公司)；DNA蛋白电泳系统(美国Bio-Rad公司)；Image Pro Plus 图像分析管理系统(美国Media Cybernetics公司)。

自液氮罐中取出冻存的C6细胞，37 ℃水浴振荡融解，用含10%小牛血清的1640培养液混匀后置于25 cm²培养瓶中，37 ℃、5%CO₂及饱和湿度条件下培养，隔日换液。

采用MTT法，将处于对数生长期的C6细胞制成单细胞悬液，按每孔6×10³ 个细胞密度均匀种于96孔板中，37 ℃、5%CO₂及饱和湿度条件下培养过夜。 次日加入DHA 0.00(对照)、0.05、0.50、5.00和50.00 μmol/L，基础培养基用含5%小牛血清的1640培养液，分别作用24、48、72 h，每个浓度设5个复孔，实验重复3次。实验终止前每孔加入MTT 20 μL继续孵育4 h，弃上清，每孔加入DMSO 150 μL，振荡使结晶溶解，在全自动酶标仪上测定各孔490 nm处吸光度(A)值，细胞生长抑制率=DHA组A值/对照组A值×100%。

将生长状态良好的C6细胞按每孔2×10⁵个密度种于6孔板中，实验设50.00 μmol/L DHA组、对照组(加入含5%小牛血清的1640培养液)，置于37 ℃、5%CO₂培养箱中培养48 h，收集细胞，磷酸盐缓冲液洗涤2 次，按照说明书操作，用1∶ 4 binding buffer 缓冲液190 μL重悬细胞，调整细胞浓度为1×10⁸个/L，然后加入FITC标记的annexin V FITC 5 μL 和20 mg/L PI 10 μL，冰浴10 min，流式细胞术检测每组中10 000个细胞，计算细胞凋亡率。

采用酶联免疫吸附实验，将C6细胞以4×10⁵个密度接种于25 cm²培养瓶中，37 ℃、5%CO₂及饱和湿度条件下培养过夜。次日加入DHA 0.00(对照)、 0.05、0.50、5.00、50.00 μmol/L；48 h后1 000 r/min离心5 min，收集细胞培养上清置于4 ℃冰箱中保存备用。在96孔板上以1∶ 1比例加入细胞培养上清和包被液，混匀后放于4 ℃冰箱中过夜，次日封闭后依次加入一抗(cyclin D1、Bax及caspase 3，1∶ 1 000稀释) 和二抗(羊抗兔IgG，1:1 000稀释)，洗板后加入显色液避光显色，待颜色呈棕黄色时，加入终止液。振荡后在酶标仪上测定各孔490 nm处吸光度(A)值。每个浓度设5个复孔，实验重复3次。

采用Western blot法，DHA 0.00(对照)、0.05、0.50、5.00、50.00 μmol/L，处理C6细胞48 h，收集各组细胞，裂解液充分裂解细胞，以12 000 g在4 ℃条件下离心15 min，取上清，读取蛋白浓度，跑胶转膜后，封闭1 h，加入一抗(Bax、Bcl-2及-actin，1∶ 1 000稀释)过夜，次日洗涤后加入二抗(羊抗兔IgG，1∶1 000稀释)置于摇床上2 h，采用增强化学发光法发光，胶片曝光拍照。采用Image Pro Plus图像分析管理系统分析，以特异性条带平均吸光度与面积的乘积为有效值，反映蛋白表达水平。

数据以 x±s表示，采用SPSS 13.0软件进行统计分析，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

≥0.05 μmol/L DHA作用C6细胞24、48、72 h时，均可抑制胶质瘤细胞生长；0.05和0.50 μmol/L DHA作用48、72 h时，C6细胞生长明显受到抑制，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)；5.00、50.00 μmol/L DHA作用24、48、72 h时，细胞的生长亦明显受到抑制，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

表 1 (Table 1)

表 1 DHA对C6细胞生长影响(%， x±s,n=5) 组别 (μmol/L) 作用时间(h) 24 48 72 对照组 100.00±2.58 100.00±1.07 100.00±2.24 DHA 0.05 100±1.54 83.96±1.08b 85.52±1.10b 0.50 94.05±3.64 74.04±3.54b 78.28±1.14b 5.00 84.15±4.81a 68.70±9.20b 55.26±1.13b 50.00 67.32±2.14b 57.25±7.01b 65.78±9.66b  注:与对照组比较，a P<0.05，b P<0.01。

表 1 DHA对C6细胞生长影响(%， x±s,n=5)

50.00 μmol/L DHA作用于C6细胞48 h 后，细胞凋亡率为[(25.98±3.95)%]，明显高于对照组[(2.32±0.78)%]，差异有统计学意义(P<0.01)。

3表达影响(表 2) 与对照组比较，各浓度DHA组C6细胞培养上清中cyclin D1、Bax蛋白含量无明显变化；与对照组比较，caspase 3蛋白含量升高，差异有统计学意义(P<0.01)。

表 2 (Table 2)

表 2 细胞培养上清中cyclin D1、Bax及caspase 3 蛋白表达( x±s,n=5) 组别 (μmol/L) CyclinD1 Bax Caspase 3 对照组 0.87±0.01 0.84±0.01 0.85±0.01 DHA 0.05 0.84±0.01 0.85±0.01 0.88±0.01a 0.50 0.83±0.01 0.87±0.01 0.90±0.01a 5.00 0.83±0.04 0.88±0.03 0.92±0.01a 50.00 0.82±0.01 0.88±0.07 0.93±0.02a  注:与空白对照组比较，a P<0.01。

表 2 细胞培养上清中cyclin D1、Bax及caspase 3 蛋白表达( x±s,n=5)

(图 1，表 3) Western blot结果显示，与对照组比较，0.05、5.00、50.00 μmol/L DHA组C6细胞中Bax表达升高、0.50、50.00 μmol/L DHA组C6细胞Bcl 2蛋白表达下降，差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组比较，0.50、5.00、50.00 μmol/L DHA组C6细胞Bax/ Bcl 2比值增加，差异有统计学意义(P<0.01)。

图 1

Fig. 1

图 1 DHA对C6细胞Bax和Bcl-2蛋白表达影响

表 3 (Table 3)

表 3 DHA对C6细胞Bax和Bcl 2 蛋白表达影响( x±s,n=5) 组别(μmol/L) Bax Bcl 2 Bax/ Bcl 2 对照组 1.00±0.05 1.23±0.06 0.80±0.05 DHA 0.05 1.07±0.02a 1.24±0.02 0.86±0.03 0.50 0.98±0.03 0.94±0.02b 1.04±0.03b 5.00 1.28±0.01b 1.13±0.09 1.13±0.09b 50.00 1.07±0.04a 0.87±0.07b 1.22±0.05b  注:与对照组比较，a P<0.05，b P<0.01。

表 3 DHA对C6细胞Bax和Bcl 2 蛋白表达影响( x±s,n=5)

胶质瘤是颅内最常见的原发性恶性肿瘤^[5]，约占颅内肿瘤的35.26%～60.90%，平均为44.60%^[6]。胶质瘤生长时与正常脑组织无明显分界或位于重要的脑功能区，导致手术切除非常困难。研究表明恶性胶质瘤单纯手术的平均生存周期仅为17周，手术结合放疗可延长至37.5周，若手术、 放疗和化疗联合使用，可延长至51周^[7]。现在，临床上迫切需要治疗胶质瘤更为有效的化疗方法。DHA可以抑制白血病、结肠癌、前列腺癌和乳腺癌等多种肿瘤细胞的生长^[2]。但是DHA对于胶质瘤的作用及机制尚不清楚。细胞生长由细胞的生长周期决定，其中cyclin D1是生长周期的主要调控蛋白之一，其表达增加会促进细胞生长^{[8, 9]}。本研究结果显示，不同浓度DHA对胶质瘤细胞的生长均有明显抑制作用，呈剂量依赖效应；DHA具有减少胶质瘤细胞分泌cyclin D1蛋白趋势。提示，DHA可能通过下调cyclin D1蛋白表达，从而抑制细胞的生长周期而发挥抑制肿瘤细胞生长的作用。

肿瘤细胞发生死亡时也会抑制细胞生长。在细胞的死亡方式中，凋亡是一种主要的死亡方式，其中，线粒体凋亡途径一直在诱导细胞凋亡的各途径中处于重要地位^{[10, 11]}。研究认为DHA可能通过线粒体介导途径使肿瘤细胞凋亡^[12]。DHA在体内具有抑制人卵巢癌细胞株HO 8910裸鼠皮下移植瘤的作用，其作用机制与caspase 3诱导细胞凋亡密切相关^[13]。本研究结果表明DHA作用后可以明显地促进肿瘤细胞凋亡，细胞中Bax蛋白表达增加，Bcl 2蛋白表达降低，Bax/Bcl 2比值明显增加，caspase 3蛋白表达亦增加。提示，DHA可能通过增加Bax/Bcl 2比值^[14]，激活线粒体凋亡途径，使caspase 3活化，导致肿瘤细胞发生凋亡。