随着微波技术的广泛应用，接触微波辐射的暴露人群越来越多，其辐射生物效应也日益受到关注。研究发现，微波辐射可引起学习记忆等脑结构和功能损伤^{[1, 2]}，但其机制尚不明确。研究表明，突触素I一方面通过磷酸化作用调节神经递质释放，另一方面通过对突触结构影响，从而在突触可塑性中起到一定作用^[3]。突触素Ⅰ有多个磷酸化位点，分别受环磷酸腺苷依赖蛋白激酶、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、Ⅰ型和Ⅱ型依赖蛋白激酶(Ca²⁺/CaM)和细胞周期素依赖性激酶5(cyclin-dependent kinase 5，Cdk5)催化^[4]。本研究拟观察微波辐射对突触素I磷酸化及其相关激酶影响，探讨其在微波辐射所致囊泡循环和氨基酸递质释放中作用，为阐明微波辐射致学习记忆障碍的机制提供依据。结果报告如下。

取出生12 h以内Wistar大鼠(军事医学科学院)，许可证号：SCXK-(军)2012—2004，剥离海马，切成1~2 mm³组织块，用0.125%胰蛋白酶37 ℃下消化25 min，吹打分散，离心制成细胞悬液。按5×10⁵个/mL密度接种细胞，置于37 ℃、5%的CO₂培养箱，24 h更换培养基，将种植液换为饲养液，每周半量换液2次，为抑制非神经元过度增殖，在培养的第4天向培养基中加入适量阿糖胞苷(每皿中加阿糖胞苷储备液30~50 μL，终浓度为3~5 μg/mL)，培养10 d后使用。

采用军事医学科学院自建微波模拟源进行辐射，原代神经元接种于35 mm培养皿中，放在辐射台上接受辐射。平均功率密度分别为30 mW/cm²，辐射时间为5 min。对照组仅放置于辐射台上5 min，不给予辐射。

采用免疫荧光法，原代海马神经元培养10 d后，于辐射前加入Ser-62/67及Ser-553位点调控激酶抑制剂U0126和roscovitine(终浓度10 μmol/L)，作用30 min；于辐射后1、6、12 h，1、2、3 d，分别取细胞爬片，甲醇丙酮(1:1)固定15 min，于4 ℃保存，以新鲜爬片进行血清封闭，0.01%TritonX-100细胞膜打孔，一抗分别以磷酸化细胞外调节激酶(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase，p-ERK)、Cdk5、Ser-62/67及Ser-553磷酸化突触素I进行标记，37 ℃孵育1 h，4 ℃过夜，二抗以异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)及四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethylrhodamine isothiocyanate，TRITC)进行标记，常温孵育1 h，PI/Hochest染核，封片，激光共聚焦显微镜观察。

采用高效液相色谱法，原代海马神经元培养10 d后，于辐射前加入U0126和roscovitine(终浓度10 μmol/L)，作用30 min；于辐射后6 h，采用30 mmol/L KCl刺激2 min后，取上清；1000 r/min离心5 min，取上清；加入10%磺基水杨酸(V/V=3:2)，5 000 r/min离心15 min；取上清，4 ℃保存；用高效液相色谱检测氨基酸神经递质，5 L衍生试剂内加入1 L样品，振荡2 min，进样针加样6 L；测得数据为被测氨基酸所占峰面积(A样)，根据标准品峰面积(A标)和浓度(C标)比，计算被测氨基酸浓度：C样(mg/mL)= C标×A样/A标。

采用time-lapse法，原代海马神经元培养10 d，于辐射前加入U0126和roscovitine(终浓度10 μmol/L)，作用30 min；于辐射后6 h，采用冰浴的缓冲液洗3次，加入5 μg/mL FM1-43染液，37 ℃孵育2 min，time-lapse实时观察囊泡循环情况。

数据以x±s表示，采用SPSS 11.0软件进行统计分析，多组间比较采用方差分析，辐射组与假辐射组比较，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

海马神经元Ser-62/67位点突触素I磷酸化表达于辐射后6 h~2 d明显减少，Ser-553位点突触素I磷酸化表达于辐射后12 h内明显减少，1 d后基本恢复。

与对照组比较(图 1A、B)，U0126组神经元内p-ERK与Ser-62/67位点(图 1C、D)突触素I磷酸化表达减弱；单纯辐射组与辐射+U0126组神经元p-ERK(图 1E、G)与Ser-62/67位点(图 1F、H)突触素I磷酸化表达明显减弱。

图 1

注：A、B：对照组；C、D：U0126组；E、F：单纯辐射组；G、H：辐射+U0126组。 图 1 U0126对微波辐射后海马神经元p-ERK及Ser-62/67突触素I磷酸化影响(×400)

与对照组比较(图 2A)，roscovitine组(图 2C)、单纯辐射组(图 2E)及辐射+roscovitine组(图 2G)Cdk5表达均明显减少；与对照组比较(图 2B)，单纯辐射组(图 2F)与辐射+roscovitine组(图 2H)Ser-553位点磷酸化突触素I表达减少。

图 2

注：A、B：对照组；C、D：roscovitine组；E、F：单纯辐射组；G、H：辐射+roscovitine组。 图 2 给予roscovitine微波辐射后海马神经元Ser-553突触素I磷酸化表达改变(×400)

辐射后γ-氨基丁酸(γ－aminobutyric acid，GABA)和甘氨酸释放明显减少。与单纯辐射组比较，给予roscovitine并辐射后GABA释放明显增加，给予U0126对辐射后氨基酸释放未见明显影响。

表 1

表 1 抑制剂对微波辐射后海马神经元氨基酸递质释放影响(mg/mL，x±s，n=5 ) 组别 谷氨酸 γ-氨基丁酸 天门冬氨酸 甘氨酸 对照组 2.80±0.23 60.10±2.26 5.91±0.54 52.76±7.24 辐射组 2.40±0.12 34.29±1.03 a 4.83±0.47 42.10±1.40 a roscovitine组 2.37±0.18 37.11±2.11 a 4.25±0.71 43.00±1.07 a 辐射+roscovitine 2.39±0.18 60.18±1.10 b 4.32±0.74 40.53±2.11 a U0126组 2.53±0.18 60.92±2.59 4.48±1.15 38.51±0.87 a 辐射+U0126 2.49±0.17 63.13±2.09 3.68±0.65 40.95±0.98 a 注：与对照组比较，a P＜0.01；与辐射组比较，b P＜0.01。

表 1 抑制剂对微波辐射后海马神经元氨基酸递质释放影响(mg/mL，x±s，n=5 )

与对照组比较，30 mW/cm²辐射后6 h，海马神经元囊泡循环速度减慢；单纯给予丝裂原活化蛋白激酶的抑制剂U0126后囊泡循环速度也减慢，但单纯给予Cdk5抑制剂roscovitine后，囊泡循环速度未见明显改变；辐射+U0126或roscovitine囊泡循环速度均减慢；辐射+roscovitine组海马神经元囊泡循环速度明显慢于单纯辐射组。

突触前突触囊泡可摄取神经递质，携递质至突触前膜，与前膜锚定、融合，并释放到突触间隙。突触素I以磷酸化形式参与囊泡转运递质过程，并促进递质释放和再循环，突触素I存在多个磷酸化位点，受不同蛋白激酶催化。研究发现，30 mW/cm²微波辐射可引起海马突触素I表达增加，但其磷酸化改变尚不明确^[5]。本研究结果显示，微波辐射后p-ERK活性降低，突触素I Ser-62/67位点的磷酸化受到抑制，进而使囊泡锚定于突触前膜障碍；而Cdk5活性降低，可促进突触素I Ser-553位点的磷酸化，进而促使囊泡锚定于突触前膜，但微波辐射早期对Cdk5的影响较弱，未能使其发挥保护性作用。本研究结果还显示，微波辐射后抑制性氨基酸释放障碍，且Cdk5活性降低可能通过促进突触素I Ser-553位点磷酸化而使包含有GABA的囊泡锚定障碍。

苯乙烯类荧光染料可用于标记追踪囊泡的胞吞胞吐及循环过程^{[6, 7]}。磷酸化突触素I参与递质释放及囊泡循环过程^{[8, 9]}。本研究结果表明，微波辐射后ERK抑制可通过下调突触素I Ser-62/67位点磷酸化而使囊泡循环受抑制；辐射后Cdk5激酶活性受抑制，突触素I Ser-553位点磷酸化受抑制，加重了辐射所致囊泡循环障碍。Cdk5在中枢神经系统发育、突触前膜的囊泡循环、轴突运输等多方面发挥重要作用^{[10, 11]}，这可能与Cdk5参与突触传递其他环节有关。

综上，30 mW/cm²微波辐射后可通过下调海马神经元ERK活性，抑制突触素I Ser-62/67位点磷酸化而使囊泡循环受抑制，囊泡锚定障碍；辐射可通过下调Cdk5表达，促进突触素I Ser-553位点磷酸化，而利于含GABA的囊泡锚定于突触前膜，但抑制囊泡循环。